连续两篇Nature 子刊，探索癌症治疗新策略！ 3D单分子荧光成像技术在纳米受体与纳米颗粒表征中起突出作用

发布日期：2024-08-14

随着科学研究向着更精细、更微观的方向发展，对成像技术的要求也日益提高。传统的光学成像技术可以提供200nm左右的分辨率，不能完全满足细胞器，以及分子水平上的研究。法国abbelight公司基于新兴单分子定位显微成像（SMLM）技术推出了3D单分子荧光成像系统-SAFe 360，能够提高定位精度，xyz三轴定位精度高达15 nm，支持同时四色成像，可以用于细胞纳米三维成像，观测高清晰亚细胞器结构，实时研究不同结构功能蛋白的共定位信息，以及在单分子水平研究分子动力学反应和细胞间的相互作用等。设备一经推出，已在Nature Nanotechnology、Science Advances 、BioRxiv等SCI期刊发表近40余篇文章。本文我们将概述3D单分子荧光成像系统表征纳米受体和纳米颗粒助力癌症研究领域的Nature子刊文章。

3D单分子荧光成像系统-SAFe 360

一、Nature Nano:纳米受体降解突变p53蛋白，助力癌症研究

肿瘤抑制因子p53在细胞中扮演着关键的角色，由TP53 基因编码，参与细胞的生长、修复及凋亡等过程的调控。超过50%的人类癌症中存在TP53突变，乳腺癌和卵巢癌中比例更高，与野生型（WT）p53相比，错义突变p53（mutp53）会稳定在细胞中积累到高水平，mutp53不仅失去了WTp53的功能，还获得了致癌功能，导致增强的肿瘤发生、侵袭、转移和对治疗的抵抗。因此靶向mutp53的增强功能成为一种有效的治疗策略，但是缺乏特异性自噬受体限制了这种治疗策略。

华南理工大学张云娇，杨显珠和南方医科大学温龙平团队开发了仿生纳米受体（NR），使用3D单分子荧光成像系统表征相关纳米受体，研究受体模拟选择性自噬受体的功能，能够结合mutp53蛋白，提高自噬小体的形成水平，增加对突变型 mutp53的降解效率。该研究以 “Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors”为题。发表于《Nature Nanotechnology》上。

研究者通过3D单分子荧光成像系统，通过随机光学重构技术（STORM），提供20 nm的超高分辨率，成功表征了NR中纳米颗粒NPs，MBP以及不同mutp53蛋白在NR中分布，标尺为100 nm，可视化展示了MBP介导的p53与NR表面的结合过程。可以观察到MBP（绿色）环绕着纳米粒子核心（红色），证明了MBP成功地共轭到纳米粒子表面。此外，当包括S241F、R175H、R248W、R280W和野生型p53在内的p53蛋白加入NR溶液时，各种mutp53蛋白（蓝色）主要位于NR的外部表面，而野生型p53的共定位较少。

比较含有不同量DOTAP的NRs，发现增加DOTAP含量能够提升在表达p53-S241F突变的卵巢癌细胞系ES-2中mutp53的清除效果，但是可能DOTAP的正电荷原因，随着DOTAP的增加，NRs的毒性也随之增加。对比后发现，20% DOTAP的NRs能够引发足够的自噬诱导作用，且其毒性可忽略不计，作为后续实验的最佳配方。

免疫荧光和Western Blot证实研究证明NRs能有效降解mutp53，而mNRs、dNRs或自由MBP肽则不能，这一点通过。NRs和dNRs能增加LC3-II水平，反映出自噬的增加，而dNRs未能降解mutp533。此外，自由DOTAP或mNRs与自由DOTAP的组合也未能降解mutp53。上述结果表明，需要在同一载体上同时存在MBP和DOTAP才能降解mutp53。

为了进一步评估NRs在临床上的潜在应用，研究者建立了p53突变（P72R+/+、C141Y+/+和L350P+/−）的患者来源的卵巢癌移植模型，小鼠在相同的13天治疗方案下分别注射PBS、CDDP、NRs或NRs-Pt。NRs有效抑制了肿瘤生长，而NRs-Pt在抑制肿瘤体积和重量方面展示出进一步增强的效果。重要的是，NRs-Pt和NRs在较小程度上增强了自噬作用，在肿瘤组织中减少了mutp53并增加了细胞凋亡。

【参考文献】

[1]. Huang, Xiaowan, et al. "Nanoreceptors promote mutant p53 protein degradation by mimicking selective autophagy receptors." Nature Nanotechnology 19.4 (2024): 545-553.

二、Nature Com：纳米颗粒特异性抗体协同调控NK细胞和T细胞实现抗肿瘤免疫

NK细胞和T细胞对于先天免疫和适应性免疫系统至关重要，并在肿瘤识别和清除中发挥互补且协调的作用。近期研究表明，靶向在NK细胞和T细胞上共表达的检查点分子，如TIGIT和NKG2A可以引发同步的先天和适应性免疫。然而，使用相应的单克隆抗体（mAbs）进行的单一疗法在临床试验中未能达到预期效果，这归因于肿瘤发病机制的复杂性，突显了将mAbs与其他检查点抑制剂结合的必要性。

近日，华南理工大学沈松，王均团队开发了一种三特异性纳米抗体（Tri-NAb），并且使用3D单分子荧光成像系统表征这些纳米颗粒以及对应抗体的位置，研究Tri-NAb通过协调NK细胞和T细胞在体外和体内显示出显著的抗肿瘤效果，体现了其协同NK细胞和T细胞的转化潜力。 该成果以“Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity”为题，发表于《Nature Communications》上。

研究者首先通过多变量筛选设计了一种具有最佳配方的生物相容性白蛋白/聚酯复合纳米颗粒（APCN），再将αPDL1/α4-1BB/αNKG2A固定在预先组装了αFc的APCN上得到Tri-Nab，Tri-Nab积聚在肿瘤中，有效触发NK细胞和CD8+ T细胞的激活（①）和增殖（②），增强它们与肿瘤细胞的相互作用（③），从而刺激细胞毒性颗粒的释放（④）。这种协调的相互作用引发了高效的肿瘤细胞凋亡（⑤）。

为了确认Tri-Nab的合成，研究者利用ELISA、电镜和3D单分子荧光成像系统进行表征，其中3D单分子荧光成像系统表征了纳米颗粒。荧光光谱显示，加入聚L-丙交酯PLLA后，HSA的内在荧光信号显著减弱，表明PLLA可能改变了围绕发光分子的疏水环境，用罗丹明B（PLLA）和iFluor™ 488（HSA）标记后，超分辨图像显示了PLLA和HSA在APCNs内准确的共定位的情况。

为验证治疗性抗体与相应抗原结合的能力，ELISA和流式分别证明了Tri-NAb的亲和力和游离的αPDL1、α4-1BB和αNKG2A无异，而且Tri-Nab可以粘附在PDL1，4-1BB和NKG2A表达的细胞上，且Tri-Nab单克隆抗体靶向结合的可能性很高。细胞实验中进一步发现NPαPDL1+α4-1BB和Tri-NAb处理组中CD8+ T细胞（绿色）与MC38肿瘤细胞（红色）之间的相互作用增强，而NPαPDL1+αNKG2A和Tri-NAb有效促进了NK细胞（蓝色）与肿瘤细胞的相互作用。

为了验证Tri-Nab在体内的效果，研究者在小鼠黑色素瘤模型中评估了Tri-NAb的治疗效果。与IgG对照组和Tri-mAbs相比，治疗NPαPDL1+α4-1BB、NPαPDL1+αNKG2A或NPα4-1BB+αNKG2A显示出在肿瘤控制方面的一些优势，而Tri-NAb表现出对肿瘤进展的更强抑制作用（图b、c）。在给药三次后，流式结果展示了肿瘤组织中的免疫细胞浸润情况。Tri-NAb处理组中的NK细胞和CD8+ T细胞的百分比和数量明显高于其他治疗组（图d–i），这表明Tri-NAb有效激活了NK细胞和CD8+ T细胞，从而增强了抗肿瘤活性。此外，小鼠的生存时间显著延长，9只小鼠中有2只实现了完全肿瘤消退（图j），而在治疗期间未观察到小鼠体重或外周血炎症细胞因子水平的显著变化。

综上所述，本研究证明了同时靶向NK细胞和CD8+ T细胞的三特异性纳米抗体的可行性和有效性，具有巨大的临床应用潜力。

【参考文献】

[1]. Ye, Qian-Ni, et al. "Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity." Nature Communications 15.1 (2024): 6211.