超分辨单分子动力分析仪(荧光光镊)-C-Trap

超分辨单分子动力分析仪(荧光光镊)-C-Trap

    


荷兰Lumicks超分辨单分子动力分析仪(荧光光镊)—C-Trap,是世界上首款将光镊、共聚焦或STED超分辨显微镜和微流控系统结合的单分子操控仪器。C-Trap通过高度聚焦激光束产生的力来操作纳米/微米颗粒,并且结合力学检测系统和共聚焦或 STED 超分辨显微镜,可以定位反应的结合位点,实时监测生物分子的单分子动力学特性。C-Trap可以揭示大量分子相互作用的机制,包括:DNA修复、复制和转录、生物分子马达和酶、DNA/RNA的结构动力学、蛋白质的折叠/去折叠、转录活性、细胞的运动机制等信息。


C-Trap荧光光镊技术特征:


√ 多重连续激光光阱捕获
√ 无与伦比的刚性范围
√ 较低的力学噪声

√ 绝对的3D捕获定位



√ 超稳定负压驱动微流体 
√ 自动控制的微流控芯片 

√ 高度相关的力学-荧光数据采集



√ 多重共聚焦扫描荧光显微镜 
√ 单光子灵敏度 

√ 可升级到STED超分辨率




C-Trap荧光光镊技术原理:


Lumicks超分辨单分子动力分析仪主要由微液流控制系统、光镊操纵系统、力学检测系统以及共聚焦(超分辨率显微镜)成像系统组成。微液流控制系统采用分通道集成设计,避免反应体系交叉污染,确保多步骤生物反应原位进行;光镊系统通过高度聚焦激光束产生的力来操作纳米或微米级的介电质颗粒,实现了对生物分子的单分子水平的操纵;结合力学检测系统和共聚焦(超分辨率显微镜)成像系统,同时从力学和光学角度,高精度定位反应的结合位点,实时监测生物分子的单分子动力学特性。


应用领域:


应用包括:利用 CTFM(Correlative Tweezers – Fluorescence Microscopy)揭示大量分子相互作用机制的详细信息,主要包括:     

DNA的修复中间纤维核糖体的翻译
细胞的运动机制DNA的复制和转录生物分子马达和酶
细胞膜的相互作用DNA-DNA的相互作用DNA发夹结构动力学 
DNA/RNA的结构动力学蛋白质的折叠(去折叠) DNA的组织化和染色质化 


DNA-蛋白互作可视化


蛋白折叠/去折叠 


细胞骨架、分子马达动力学的研究


小分子、酶活性的研究



C-Trap荧光光镊规格参数:


■ 光镊:


检测范围:50μm × 50μm × 35μm(x,y,z)

独立光阱数目:1-4

光阱类型:持续的激光提供稳定精确的高强度捕获

力学检测分辨率:<0.1pN @100Hz, 2μm 聚苯乙烯微球(由生物样品决定)

最大逃逸力:1000pN , 4.5μm 聚苯乙烯微球

应力稳定性:<1pN 

光阱转角频率:0.1kHz-15kHz

光阱距离分辨率:<0.3nm @100Hz

小步移:<0.5nm

光阱移动特性:所有光阱可在 x,y 平面独立移动;1+2,3+4 可在三维空间成对移动

运动微球追踪精确度:<3nm @ 100Hz 视频分析


■ 共聚焦显微镜:


可视范围:50μm×35μm(x,y)

共聚焦颜色*:多可三色共用,从 488nm 到 647nm 之间的十种波长中选择

共聚焦分辨率: 衍射极限之内

STED 分辨率*:<35nm

扫描速度:线性扫描速度 200Hz

定位精度:<15nm

光斑定位精确度:<1nm

背景抑制极限:100nM @1ms 积分时间

敏感度:极低的亮度检测极限以及单光子计数。可检测单个 eGFP

其他值得注意的特点:和光镊完美的结合,交互式体验


■ u-Flux 微流控:


微流控流动系统:负压系统可以在层流环境下检测到亚纳米级别的位移

用于远程操控的自动阀

无位移偏差

单分子测量零干扰

多达11个注射器可以接到流动池上来实现复杂的多重蛋白分析


■ 软件:


C-Trap便捷直观的双屏显示界面给您的实验操作带来极大便利;您可通过手动点击操纵杆或通过简单的命令来自动控制诸如光阱位置,平台位置,微流体以及数据记录等过程。以用户为中心的软件操作界面以及简易的操作流程使复杂的单分子实验过程(微球捕获,分子的连接,随后的操纵以及成像整个过程)在数分钟之内即可完成。



■ Cell (2019): CMG解旋酶在DNA复制过程中的运动


最近在Cell杂志上发表的一篇文章,阐述了CMG解旋酶在DNA复制过程中的作用及其在单链DNA与双链DNA之间的移动。科学家使用C-Trap光镊-荧光共聚焦显微镜联用系统,清晰地观察到CMG解旋酶退出与重新进入复制叉区域的运动;揭示了CMG这种在结合双链DNA和复制叉处单链DNA时表现出不同功能状态内在转变调节的“门控(gating)”机制。

 


 

 ■ eLife (2019): RecBCD解旋酶的亚基在DNA修复前如何共同作用进行DNA解旋?

 

Zananiri的研究组将u-Flux层流微流控系统与光镊联用以研究大肠杆菌中的RecBCD解旋酶及其亚基的功能。研究小组发现,在解旋过程中RecBCD可以产生高达40 pN(25-40 pN)的力;同时,RecD亚基可作为快速的单链DNA转位酶。他们的研究发现使得科学家们对RecBCD诱导的DNA解旋相关的蛋白置换机制有了更深入的了解。



 

■ 最新应用 (2019):使用C-Trap实时操纵并研究细胞内信号转导——细胞操纵与细胞成像同时进行! 

 

来自Columbia University、UC Davis和University of Minnesota的研究组共同合作,借助C-Trap光镊-荧光共聚焦显微镜联用系统进行了细胞与受体之间相互作用的研究;涉及到了细胞信号转导、丝状伪足形成与脂滴融合等领域。除此之外,荧光光镊C-Trap™系统凭借其绝对的3D捕获定位、无与伦比的刚性范围、超稳定负压驱动微流体、单光子灵敏度等优势,已在DNA修复、DNA复制转录、核糖体翻译、生物分子马达及酶、细胞膜的相互作用、DNA-DNA相互作用、DNA发夹结构动力学、蛋白质折叠(去折叠)、DNA组织化和染色质化、细胞运动机制等诸多应用方向上取得了重要成果。



 

■ 利用荧光光镊系统对Cas9脱靶效应进行实时可视化评估

 

CRISPR-Cas9作为一种有效的基因编辑方法,在疾病预防与治疗中具有巨大的潜能,但是在临床转化中必须要考虑到它的脱靶效应。传统的生物学手段如电泳或测序等,虽然也可以用来研究Cas9的靶向性,但是其结果大多数为静态的、平均的。2019年3月发表在Nature Structural and Molecular Biology期刊上的最新文章 ,采用最新的荧光光镊技术,利用光镊操纵DNA模板,结合共聚焦荧光显微成像系统,实现了在单分子水平动态的观察Cas9对目的基因的靶向编辑。


结果表明,当DNA松弛时,CRISPR的编辑具有特异性,但是当DNA被拉伸时,CRISPR编辑准确性降低,并出现脱靶编辑,其脱靶的概率随着受力的增加而增加。这项研究将有助于设计具有更高准确度的CRISPR系统。



更多应用案例,请您致电 010-85120280 或 写信至 info@qd-china.com 获取。


1.  Naqvi M M, Avellaneda M J, Roth A, et al. Polypeptide collapse modulation and folding stimulation by GroEL-ES. bioRxiv, 2020

2.  Ghosh A, Zhou H X. Fusion Speed of Biomolecular Condensates. bioRxiv, 2020

3.  Alshareedah I, Moosa M M, Raju M, et al. Phase Transition of RNA-protein Complexes into Ordered Hollow Condensates. bioRxiv, 2020

4.  Meijering A E C, Biebricher A S, Sitters G, et al. Imaging unlabeled proteins on DNA with super-resolution. Nucleic acids research, 2020

5.  Wruck F, Tian P, Kudva R, et al. The ribosome modulates folding inside the ribosomal exit tunnel. BioRxiv, 2020

6.  Kraxner J, Lorenz C, Menzel J, et al. Post-Translational Modifications Soften Intermediate Filaments. bioRxiv, 2020

7.  Avellaneda M J, Koers E J, Minde D P, et al. Simultaneous sensing and imaging of individual biomolecular complexes enabled by modular DNA–protein coupling. Communications Chemistry, 2020

8.  Spakman D, King G A, Peterman E J G, et al. Constructing arrays of nucleosome positioning sequences using Gibson Assembly for single-molecule studies. Scientific reports, 2020

9.  Schaedel L, Lorenz C, Schepers A V, et al. Vimentin Intermediate Filaments Stabilize Dynamic Microtubules by Direct Interactions. bioRxiv, 2020

10.  Avellaneda M J, Franke K B, Sunderlikova V, et al. Processive extrusion of polypeptide loops by a Hsp100 disaggregase. Nature, 2020

11.  Hill C H, Napthine S, Pekarek L, et al. Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control. bioRxiv, 2020

12.  Qin Z, Bi L, Hou X M, et al. Human RPA activates BLM’s bidirectional DNA unwinding from a nick. Elife, 2020

13.  Rill N, Mukhortava A, Lorenz S, et al. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020

14.  Mei L, de los Reyes S E, Reynolds M J, et al. Molecular mechanism for direct actin force-sensing by α-catenin. bioRxiv, 2020

15.  Kucera O, Janda D, Siahaan V, et al. Anillin propels myosin-independent constriction of actin rings. bioRxiv, 2020

16.  Schepers A V, Lorenz C, Köster S. Tuning intermediate filament mechanics by variation of pH and ion charges. Nanoscale, 2020

17.  Khawaja A, Itoh Y, Remes C, et al. Distinct pre-initiation steps in human mitochondrial translation. Nature Communications, 2020

18.  Sorkin R, Marchetti M, Logtenberg E, et al. Synaptotagmin-1 and Doc2b Exhibit Distinct Membrane-Remodeling Mechanisms. Biophysical journal, 2020

19.  Van Rosmalen M G M, Kamsma D, Biebricher A S, et al. Revealing in real-time a multistep assembly mechanism for SV40 virus-like particles. Science Advances, 2020

20.  Kretzer B, Kiss B, Tordai H, et al. Single-Molecule Mechanics in Ligand Concentration Gradient. Micromachines, 2020

21.  Raja A, Hadizadeh N, Candelli A. Optical tweezers and multimodality imaging: a platform for dynamic single‐molecule analysis. The FASEB Journal, 2020

22.  Zananiri R, Malik O, Rudnizky S, et al. Synergy between RecBCD subunits is essential for efficient DNA unwinding. Elife, 2019

23.  Leicher R, Eva J G, Lin X, et al. PRC2 bridges non-adjacent nucleosomes to establish heterochromatin. bioRxiv, 2019

24.  Tafoya S, Large S J, Liu S, et al. Using a system’s equilibrium behavior to reduce its energy dissipation in nonequilibrium processes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019

25.  King G A, Burla F, Peterman E J G, et al. Supercoiling DNA optically. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019

26.  Lorenz C, Forsting J, Schepers A V, et al. Lateral subunit coupling determines intermediate filament mechanics. Physical review letters, 2019

27.  Kaur T, Alshareedah I, Wang W, et al. Molecular crowding tunes material states of ribonucleoprotein condensates. Biomolecules, 2019

28.  Wasserman et al., Replication Fork Activation Is Enabled by a Single-Stranded DNA Gate in CMG Helicase. Cell, 2019

29.  Orsenski et al., Sites of high local frustration in DNA origami. Nature Communication, 2019

30.  Newton et al., DNA stretching induces Cas9 off-target activity. Nature Structural Molecular Biology, 2019

31.  Nanoletters, Real-Time Assembly of Viruslike Nucleocapsids Elucidated at the Single-Particle Level. Marchetti et al., 2019

32.  Zheng et al., Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communication, 2019

33.  Gui et al., Structural basis for reversible amyloids of hnRNPA1 elucidates their role in stress granule assembly. Nature Communication, 2019

34.  Alshareedah et al., Interplay between Short-Range Attraction and Long-Range Repulsion Controls Reentrant Liquid Condensation of Ribonucleoprotein–RNA Complexes. JACS, 2019

35.  Forsting et al., Vimentin intermediate filaments undergo irreversible conformational changes during cyclic loading. Nanoletters, 2019

36.  Gutierrez-Escribano et al., A conserved ATP- and Scc2/4-dependent activity for cohesin in tethering DNA molecules. Science Advances, 2019

37.  Sarah Koster (University of Gottingen), Viscoelastic properties of vimentin originate from nonequilibrium conformational changes. Science Advances, 2018

38.  Anthony Hyman (MPI-CBG), Salt-Dependent Rheology and Surface Tension of Protein Condensates Using Optical Traps. Physical Review Letters, 2018

39.  Sarah Koster (University of Gottingen), Nonlinear Loading-Rate-Dependent Force Response of Individual Vimentin Intermediate Filaments to Applied Strain. Physical Review Letters, 2017

40.  Ineke Brouwer,Sliding sleeves of XRCC4–XLF bridge DNA and connect fragments of broken DNA and connect fragments of broken DNA.Nature, 2016

41.  Douwe Kamsma, Tuning the Music: Acoustic Force Spectroscopy (AFS) 2.0. Methods, 2016

42.  Nicholas A, Fibrin Networks Support Recurring Mechanical Loads by Adapting their Structure across Multiple Scales. Biophysical Journal,2016

43.  Gerrit Sitters, Acoustic force spectroscopy. Nature methods, 2015

44.  Andrea Candelli, Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution. PNAS, 2014

45.  Iddo Heller, STED nanoscopy combined with optical tweezers reveals protein dynamics on densely covered DNA. Nature methods, 2014




让单分子研究更简单——LUMICKS单分子荧光光镊系统新用户培训

— —清华大学史航教授专访



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