1. 荧光成像与O-PTIR联合表征
荧光成像对于分子生物学机制的研究具有十分重要的意义,而传统红外很难原位测量细胞的红外图谱,因此无法将蛋白定位与原位细胞的红外图谱进行原位叠合,这对于红外在生物学的机制研究中的应用十分不利。而O-PTIR能够直接在不损伤细胞的情况下测量不同区域的红外图谱,与荧光图像相结合探究蛋白结构与分布上的变化。
图1. 阿尔兹海默症脑组织切片样品,左侧白光图,中间荧光图,右侧O-PTIR在中图中的红色与蓝色区域的采集的红外图谱
2. 感染疟原虫的红细胞表征
疟原虫属寄生虫引起的疟疾是威胁生命的主要疾病之一,而疟原虫引发的感染周期十分复杂,因此在细胞和分子水平观察疟原虫的变化对于研究疟原虫的致病有着重要意义。Agnieszka M. Banas等人通过使用O-PTIR对疟原虫感染的红细胞在亚微米尺度的分子特征变化进行了表征,结果显示正常红细胞的蛋白呈现环状分布,而感染后的红细胞蛋白质则呈现无规则分布。通过对比传统FTIR与基于O-PTIR技术能够发现,O-PTIR能够提供更为详细的图像分辨率并且能够测量红细胞不同位置的光谱信息。而传统FTIR受制于米氏散射限制,效果较差。

图2. 对比FTIR与O-PTIR对红细胞成像的结果:(a)红细胞的白光图;(b)图a中红色方块放大的区域;(c,e)FTIR的蛋白/脂质空间分布的红外成像;(d,f)O-PTIR的蛋白/脂质空间分布的红外成像;(g)红细胞的FTIR红外光谱;(h)红细胞的O-PTIR红外光谱;(g,i)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的PCA(PC1&PC2,PC1&PC3)得分;(h,j)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的PCA(PC1&PC2,PC1&PC3)得分
参考文献:B. [Malaria] “Comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (Nature Communication Chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
3. 单个病毒的红外成像
受制于红外极限分辨率的限制,单个病毒的红外光谱成像一直以来都是十分困难的,对于只有100 nm左右的病毒进行红外光谱成像显得十分无力。Yi Zhang等人使用O-PTIR技术成功实现对单个痘病毒进行了检测,并成功观测到了病毒的外形,同时对病毒表面的蛋白的光谱进行了表征。

图3. 单个痘病毒的光谱和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射图像;(b)痘病毒1550cm-1波数下的MIP图像;(c)痘病毒1650cm-1波数下的MIP图像;(d)随机选取病毒上4个点的光谱
参考文献:“Vibrational Spectroscopic Detection of a Single Virus by Mid-Infrared Photothermal Microscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
4. 光学光热红外O-PTIR与Raman光谱协同分析固定或活的单细胞
英国曼彻斯特大学的Peter Gardner教授近期发表了他们关于活(和固定)细胞振动光谱分析的研究结果。作者使用光学光热红外O-PTIR与Raman光谱,并借助于两个激发源(QCL和OPO激光器),对细胞进行了宽光谱范围的覆盖,从而使所有与生物学相关的分子振动都能被检测到,且保持一致的亚微米的空间分辨率。此外,红外光谱采集与拉曼光谱有效的结合起来,在相同的激发位置,形成振动互补,得到一套完整的振动光谱信息。如下图所示,该红外和拉曼的组合方式可以用来分析液体环境中固定或活细胞的亚细胞结构,其中的蛋白质二次结构及富脂体均可以在亚微米尺度上被有效地识别出来。

图4. O-PTIR观测固定未染色MIA PaCa-2细胞成像。(a)固定的未染色的MIA PaCa-2细胞的光学图像;(b)红色方块区域的放大图像;(c)OPO波束段的O-PTIR红外光谱;(d)QCL波束段O-PTIR的红外光谱;(e)黑色区域的拉曼和红外光谱
参考文献:D. [Mammalian cancer cell] “Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). Advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
5. O-PTIR与S-XRF联用探究阿尔兹海默症
阿尔兹海默症(AD)是老年痴呆症常见的病症之一,而淀粉样β蛋白沉淀是引发AD的重要病因之一,因此对于淀粉样β蛋白分布的研究就显得十分重要。Nadja Gustavsson等人通过O-PTIR成功观测到了神经中的淀粉样β蛋白分布,并且结合S-XRF分析发现铁簇与淀粉样β-折叠结构和氧化的脂质存在共定位关系。这项研究充分预示了O-PTIR/S-XRF联合技术可在AD疾病的研究中发挥重要作用。

图5. 单个神经元的O-PTIR与X光荧光成像。(a)单个神经元的光学(左)与O-PTIR图像(中和右);(b)神经元上铜、铁的分布;(c)铁与蛋白叠合图;(d)铁与脂质的叠合图