你了解不怕水，无制样要求的红外成像吗？无需任何标记鉴别生物样品，病毒、单细胞、活细胞观测统统不在话下！
发布日期：2022-02-10
近年来，红外光谱和显微成像技术有了突飞猛进的发展,尤其是在生命科学领域，得益于红外光谱技术对于分子结构的敏感性，其能够在无任何标记的情况下实现对生物样品成分的鉴定和分布解析，这对于不便于荧光标记的一些生物样品鉴别十分有利。然而目前大多数的红外光谱空间分辨率受限于红外光的衍射极限，只有10-20 μm，且依赖于红外光波波长。另外多数红外检测设备对于生物样品制样过程也有着严格要求，如样品切片厚度，细胞和组织尺寸，含水量，需要荧光染色等，这对于生命科学研究非常不利。
针对上述问题，美国Photothermal Spectroscopy Corp公司经多年潜心攻关，研发出非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统—mIRage，该设备凭借其独有的光学光热红外（O-PTIR, Optical Photothermal Infrared）技术克服了上述问题，将红外光谱的空间分辨率提升亚微米（~500 nm）；无需制备薄片，直接测试较厚样品，地简化了制样过程、提高测试效率；同时可实现无接触式地快速简易测量，有效避免了传统ATR模式下的散射像差和交叉污染。且该设备在反射模式下所得谱图与透射模式下FTIR完全一致，还可以选配透射模式，十分适用于液体样品和一些特殊混合样品，的扩展了光热红外在生命科学领域的应用范围(如图1所示)。这项先进技术让mIRage有别于传统的红外测试设备，能够对生命科学领域的常用样本，诸如细胞爬片，病理组织切片，单细胞细菌等有良好的兼容性，并让活细胞观测成为可能。除此之外，mIRage还可与拉曼光谱进行联用，实现同时同地相同分辨率的IR和Raman测试，且无荧光风险，能够帮助研究者更快速全面的确定所分析生物样品的化学组成信息。
图1. O-PTIR光学光热红外显微镜，工作原理及钙化乳腺组织的O-PTIR红外成像图
光学光热红外O-PTIR在生命科学领域应用的显著优势：
1.亚微米级的空间分辨率；
2.可直接获取液体中活细胞的红外成像；
3.灵敏度高，可直接观测单细胞 (如细菌、哺乳动物细胞等)；
4.无米氏散射干扰，即使在细胞边缘也不受影响；
5.高的光谱分辨率；
6.无需直接接触即可测量软组织的红外光谱；
7.可实现红外和拉曼同步测量；
8.可实现超过10 μm厚的样品测试，直接置于载玻片上观察分析；
9.可配置极化的红外光源；
典型案例分析：
1.感染疟原虫的红细胞表征
疟原虫属寄生虫引起的疟疾是威胁生命的主要疾病之一，而疟原虫引发的感染周期十分复杂，因此在细胞和分子水平观察疟原虫的变化对于研究疟原虫的致病有着重要意义。Agnieszka M. Banas等人通过使用O-PTIR对疟原虫感染的红细胞在亚微米尺度的分子特征变化进行了表征，结果显示正常红细胞的蛋白呈现环状分布，而感染后的红细胞蛋白质则呈现无规则分布。通过对比传统FTIR与基于O-PTIR技术能够发现，O-PTIR能够提供更为详细的图像分辨率并且能够测量红细胞不同位置的光谱信息。而传统FTIR受制于米氏散射限制，效果较差。
图2. 对比FTIR与O-PTIR对红细胞成像的结果：(a)红细胞的白光图；(b)图a中红色方块放大的区域；(c,e)FTIR的蛋白/脂质空间分布的红外成像；(d,f)O-PTIR的蛋白/脂质空间分布的红外成像；(g)红细胞的FTIR红外光谱；(h)红细胞的O-PTIR红外光谱;(g,i)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分；(h,j)疟原虫感染红细胞和正常红细胞的PCA（PC1&PC2，PC1&PC3）得分
参考文献：
B. [Malaria] “Comparing infrared spectroscopic methods for the characterization of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes” (Nature Communication Chemistry, https://doi.org/10.1038/s42004-021-00567-2). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
2.单个病毒的红外成像
受制于红外极限分辨率的限制，单个病毒的红外光谱成像一直以来都是十分困难的，对于只有100 nm左右的病毒进行红外光谱成像显得十分无力。Yi Zhang等人使用O-PTIR技术成功实现对单个痘病毒进行了检测，并成功观测到了病毒的外形，并对病毒表面的蛋白的光谱进行了表征。
图3.单个痘病毒的光谱和成像表征。(a)痘病毒的干涉散射图像;(b)痘病毒1550cm-1波束下的MIP图像;(c)痘病毒1650cm-1波束下的MIP图像;(d)随机选取病毒上4个点的光谱
参考文献：
“Vibrational Spectroscopic Detection of a Single Virus by Mid-Infrared Photothermal Microscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c05333). Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
3. 光学光热红外O-PTIR与Raman光谱协同分析固定或活的单细胞
英国曼彻斯特大学的Peter Gardner教授近期发表了他们关于活(和固定)细胞振动光谱分析的新研究结果。作者使用光学光热红外O-PTIR与Raman光谱，并借助于两个激发源（QCL和OPO激光器），对细胞进行了宽光谱范围的覆盖，从而使所有与生物学相关的分子振动都能被检测到，且保持一致的亚微米的空间分辨率。此外，红外光谱采集与拉曼光谱有效的结合起来，在相同的激发位置，形成振动互补，得到一套完整的振动光谱信息。如下图所示，该红外和拉曼的组合方式可以用来分析液体环境中固定或活细胞的亚细胞结构，其中的蛋白质二次结构及富脂体均可以在亚微米尺度上被有效地识别出来。
图4. O-PTIR观测固定未染色MIA PaCa-2细胞成像。(a)固定的未染色的MIA PaCa-2细胞的光学图像；(b)红色方块区域的放大图像；(c)OPO波束段的O-PTIR红外光谱；(d)QCL波束段O-PTIR的红外光谱；(e)黑色区域的拉曼和红外光谱
参考文献
D. [Mammalian cancer cell] “Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy” (Analytical Chemistry, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c04846). Advantages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
4. O-PTIR与S-XRF联用探究阿尔兹海默症
阿尔兹海默症是老年痴呆症常见的病因之一，而淀粉样β蛋白沉淀是引发AD的重要病因之一，因此对于淀粉样β蛋白分布的研究就显得十分重要。Nadja Gustavsson等人通过O-PTIR成功观测到了神经中的淀粉样β蛋白分布，并且结合S-XRF分析发现铁簇与淀粉样β-折叠结构和氧化的脂质存在共定位关系。这项研究充分预示了O-PTIR/S-XRF联合技术可在AD疾病的研究中发挥重要作用。
图5.单个神经元的O-PTIR与X光荧光成像。（a）单个神经元的光学（左）与O-PTIR图像（中和右）（b）神经元上铜、铁的分布（c）铁与蛋白叠合图（d）铁与脂质的叠合图
参考文献
[Neuron] “Correlative optical photothermal infrared and X-ray fluorescence for chemical imaging of trace elements and relevant molecular structures directly in neurons” (“Light: Science & Applications” https://doi.org/10.1038/s41377-021-00590-x) Advantages: 1, 3, 4, 5, 6
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