Quantum Design-双光子3D组织切割成像系统-TissueSurgeon

双光子3D组织切割成像系统-TissueSurgeon

一款更适合切小鼠胫骨等小鼠骨骼系统，牙齿的激光切片设备

德国LLS ROWIAK公司的TissueSurgeon是一款专门设计的快速、方便、灵活的组织切片机设备。该设备使用高速高能激光系统，能够对样品实施如同外科手术般的精准的非接触式切割。其独特的多光子切割技术有别于目前市场上的任何产品，能够从样品中的任意位置开始，直接在指定的样品部位直接进行切割并且不会对样品部位造成灼伤。

应用领域

■ 10~100 μm厚度的无脱钙硬组织切割（小鼠胫骨等小鼠骨骼系统，牙齿等）

■ 软组织固定、无固定切割

■ 硬、软组织的表观遗传、基因表达、生理代谢指标的测定

■ 基于MPM、OCT定位的精准切割

■ 深层组织的多光子成像观测（FL、SHG、THG）

传统切割方法

骨骼的大部分细节信息都被机械力破坏，

并且染色效果也并不理想

ROWIAK激光切割

骨骼的大部分信息均被良好地保留下来，并且

染色效果好于传统切片的染色效果

TissueSurgeon有别于传统的薄片切割系统，这种切割无需借助外力，能够有效避免金属刀片带来的金属污染和机械力损伤。这种切割技术也克服了传统激光切割技术必须从表面开始切割并且会灼烧样品的缺点。

TissueSurgeon使用独特的双光子切割技术，有效避免传统激光切割缺点，真正做到了从任意点开始的3D切割，并且对于样品没有灼烧。

为何选用TissueSurgeon？

■ 更适合样本种类：小鼠胫骨等小鼠骨骼系统，牙齿，样本较小；

■ 更适合高精度的激光切割，切片后直接染色成像；

■ 可切割的样品种类：牙齿、骨骼等生物硬组织，各种聚合物材料，软组织，含有金属的硬组织或者软组织；

■ 样品处理方式：硬组织无需脱钙、软组织无需固定；

■ 可适用染色方法：HE染色常规及TRAP、Masson等特殊染色方法；

■ 切片过程全自动控制；

■ 薄切片厚度：硬组织切片10 µm；

■ 切片速度：≥1 mm^²/s；

■ 切割过程不会污染、灼伤或机械力损伤样品；

■ 激光光源类型：红外飞秒脉冲激光；

■ 成像技术：光学相干断层扫描（OCT）。

■ TissueSurgeon可视化切片系统，实现边看边切

对于病理等多种研究来说，涉及到组织切片，困难的部分莫过于寻找病变部位。相比一个完整组织来说，有时候研究者所关注的部分仅仅是其中变异的一小部分组织的形态而已。但是对于传统切片手段来说，缺乏一种有效的手段来定位这个区域，因此往往需要投入大量人力和物力去多次制样，大量切片来寻找这个部位。 TissueSurgeon 自身集成了适合深层组织细胞成像的光学相干断层扫描（OCT）成像功能，帮助您直接定位到 ROI 区域。让切片变得可视化，实现更加精准和可控的切片，为研究者更加迅速直观的找到病变位置，大大提高了研究效率。

大鼠膝关节的OCT成像

大鼠膝关节的OCT 3D重构

对含有金属钉的骨骼进行成OCT成像，并引导切片

■ 原位细胞3D切割成像技术基于青鳉胚胎组织的单细胞提取

单细胞的原位组织提取一直以来都是一项十分困难的工作，这主要受制于组织之间连接致密难以消化，而机械力往往很难精确地将单个细胞与组织完整的分离。激光切割具有传统切割技术所难以匹及的切割精度，是目前一种比较理想的切割手段，因此围绕激光切割技术的相关显微产品也孕育而生，并在科研领域中越来越受到关注。但是激光切割也有其局限性，首先显微激光切割往往要从表面开始，无法对深层组织进行切割；另一方面激光的光源往往采用紫外激光光源，这种类型的光源很容易造成组织灼伤，从而影响切割下来样品的品质，因此激光切割的应用发展也受到了诸多限制。

如今ROWIAK公司推出的一款全新的单细胞分离系统有望解决这一难题。它采用了近红外双光子激光切割技术，在保留了激光切割精度优势的同时，采用近红外波长的激光从而避免了激光切中对组织灼烧的问题。因此能够实现精准的原位组织中的单个细胞的分离。

双光子3D组织切割成像系统TissueSurgeon

发育中的青鳉胚胎

青鳉是一种成熟的模式生物，常用于分析发育和发育过程中的细胞信号神经生物学研究。其中使用表达荧光蛋白的转基因胚胎是一种揭示胚胎发育的良好方法。随着基因技术的发展，研究者们越来越多地开始关注这些标记细胞中转录组中的信息。虽然单细胞测序技术发展迅速，但是从组织中获得单细胞的手段却十分有限。目前几乎没有手段能够直接在组织的原位上快速获取一个细胞，但是基于ROWIAK双光子切割技术，研究者成功地在这方面取得了一些进展。

青鳉胚胎中感知神经中表达mcherry的细胞成像

研究者为了研究青鳉感觉神经分泌细胞细胞群中特定表达m-cherry的转基因细胞的内部遗传信息，将ROWIAK双光子3D组织切割成像系统与传统的显微操作系统进行结合，成功实现了对目标细胞的原位分离。

研究者首先利用双光子3D组织切割成像系统对青鳉胚胎中的mcherry细胞进行了定位，然后根据其细胞群的形态设定了切割部位，随后系统根据预先设定的范围进行切割。待切割完成后使用玻璃微管移液器将目标的细胞部位直接取出，即获得了目标组织区域。这种方法能够在不破坏样品原位信息的情况下将感兴趣的部位直接精准的分离，这对于揭示生物体的基因表达情况具有着深远的意义。

从青鳉胚胎中分离特定表达mcherry的细胞团

参考文献：
Wittbrodt, J. et al. Medaka — a model organism from the Far East. Nature Reviews Genetics 3, 53-64.
Yamamoto, T. (ed.) MEDAKA (Killifish): Biology and strains. Yamamoto, T. (ed.) Keigaku Pub. Co., Tokyo, 1975, pp.365.
Kristin Tessmar-Raible et al.Removal of fluorescently-labeled sensory-neurosecretory cells from forebrain of transgenic Medaka embryos, focusonmicroscop. 2011.

染色(缩写)	染色	图像	描述
ABFR	阿尔新蓝-核固红		狗，唾液腺：核仁：红色微酸粘蛋白：蓝色
ABFR	阿尔新蓝-核固红		大鼠股骨(未脱钙)：软骨细胞外基质：蓝色
CF	纤维蛋白-卡斯塔莱斯		兔血管：纤维蛋白：亮红色血小板：灰到深蓝色胶原：亮蓝色肌肉：红色红细胞：明黄色
EVG	Elastica Van Gieson染色		兔，带支架血管：核：褐色结缔组织：黄色弹性纤维：紫色肌肉：红色 Plasma：红色
EO	伊红		狗爪（未脱钙）：骨细胞，荧光
HE	苏木精和伊红		带支架兔冠状动脉：核：蓝色其余组织：红色
LL	Levai-Laczko染色		羊骨连接处（未脱钙）：核:violett-blue 细胞质：蓝色红细胞：深蓝色软骨基质：亮蓝色骨基质：鲜红色类骨质：紫色纤维：蓝紫色
McN	McNeil Tetra Chrome染色		狗胫骨（未脱钙）：骨：粉红色/红色细胞和细胞核：蓝色软骨：紫色结缔组织：红/粉红色
MG	Masson Goldner Trichchrome with light green and anilin blue染色		小鼠股骨(未脱钙)，生长板：骨：绿色类骨质：橙色软骨：粉红色肌肉纤维：红色胶原蛋白：绿色细胞质：粉红色核：棕色
MP	Movat Pentachrome染色		狗爪（未脱钙）：核仁：蓝-黑色肌肉组织：红色基质：蓝色胶原：蛋白:黄色软骨:：蓝-绿色弹性纤维：黑色骨：黄-红色
Nissl	尼氏染色法		人脑：核和尼氏体：红紫罗兰色/紫罗兰色细胞质和其他组织：亮蓝色到亮紫罗兰色
Sirius	天狼星红		人主动脉斑块：纤维组织：红色
SRS	Sanderson Rapid Stain染色		鼠下颌骨（未脱钙）：骨和细胞核：蓝色
SRS + VG	Sanderson Rapid Stain + van Gieson染色		大鼠股骨(未脱钙)，生长板：骨：粉红色骨髓细胞：蓝色到紫色生长板软骨：红色
VEL	Verhoeffs Elastica染色		兔，带支架血管：弹性纤维：黑色其余组织：红色

[1] Donath, Sören, Leon Angerstein, Lara Gentemann, Dominik Müller, Anna E. Seidler, Christian Jesinghaus, André Bleich, Alexander Heisterkamp, Manuela Buettner, and Stefan Kalies. 2022. "Investigation of Colonic Regeneration via Precise Damage Application Using Femtosecond Laser-Based Nanosurgery" Cells 11, no. 7: 1143.

[2] Müller, Dominik, Sören Donath, Emanuel G. Brückner, Santoshi Biswanath Devadas, Fiene Daniel, Lara Gentemann, Robert Zweigerdt, Alexander Heisterkamp, and Stefan M.K. Kalies. (2021). "How Localized Z-Disc Damage Affects Force Generation and Gene Expression in Cardiomyocytes" Bioengineering 8, no. 12: 213.

[3] Müller D, Klamt T, Gentemann L, Heisterkamp A, Kalies SMK (2021) Evaluation of laser induced sarcomere micro-damage: Role of damage extent and location in cardiomyocytes. PLoS ONE 16(6): e0252346.

[4] Bouyer M; Garot C; Machillot P; Vollaire J; Fitzpatrick V; Morand S; Boutonnat J; Josserand V; Bettega G; Picart C (2021) 3D-printed scaffold combined to 2D osteoinductive coatings to repair a critical-size mandibular bone defect Materials Today Bio 11 (2021) 100113.

[5] Verhaegen C, Kautbally S, Zapareto D C, Brusa D, Courtoy G, Aydin S, Bouzin C, Oury C, Bertrand L, Jacques P J, Beauloye C, Horman S, Kefer J (2020) Early thrombogenicity of coronary stents: comparison of bioresorbable polymer sirolimus-eluting and bare metal stents in an aortic rat model. Am J Cardiovasc Dis. 10(2):72-83.

[6] Zeller-Plumhoff B, Malicha C, Krüger D, Campbella G, Wiesea B, Galli S, Wennerberg A, WillumeitRömer R, Wieland F (2020) Analysis of the bone ultrastructure around biodegradable Mg–x Gd implants using small angle X-ray scattering and X-ray diffraction Acta Biomaterialia 101 637–645.

[7] Müller, D., Hagenah, D., Biswanath, S., Coffee, M., Kampmann, A., Zweigerdt, R., Heisterkamp, A., Kalies, S.M.K., (2019). Femtosecond laser-based nanosurgery reveals the endogenous regeneration of single Z-discs including physiological consequences for cardiomyocytes. Scientific Reports 9, 3625.

[8] Rousselle S D , Wicks J R, Tabb B C, Tellez A, O’Brien M (2019) Histology Strategies for Medical Implants and Interventional Device Studies Toxicologic Pathology Vol. 47(3) 235-249.

[9] Neuerburg C, Mittlmeier L M, Keppler A M, Westphal I, Glass Ä, Saller M M, Herlyn P K E, Richter H, Böcker W, Schieker M, Aszodi A, Fischer D C (2019) Growth factor-mediated augmentation of long bones: evaluation of a BMP-7 loaded thermoresponsive hydrogel in a murine femoral intramedullary injection model. Journal of Orthopaedic Surgery and Research 14 297.

[10] Kunert-Keil C, Richter H, Zeidler-Rentzsch I, Bleeker I, Gredes T (2019) Histological comparison between laser microtome sections and ground specimens of implant-containing tissues. Annals of Anatomy 222 153–157.