Scientific Reports：使用单外泌体表征分析技术与蛋白组学检测乏氧状态的肾细胞癌外泌体

肾细胞癌（RCC）是很常见的一种肾脏癌症。RCC现在仍然缺少有效的医学诊断指标，已经成为RCC治疗方法开发的大挑战。外泌体是一种潜在的癌症诊断指标，细胞分泌的外泌体的组成会因细胞的生理状态不同而发生变化。肿瘤内乏氧是癌症发生、发展及扩散的一个关键因素。研究表明，处于乏氧状态的细胞分泌的外泌体会影响癌细胞的增殖、扩散以及肿瘤血管生成，且与外泌体的内容物有关。外泌体内容物的表型可以通过蛋白组学和转录组学方法检测，但这些方法过于繁琐，难以用于医学诊断。

单个外泌体表型分析是将免疫学与光学结合的一种新技术。该技术首先利用免疫识别将特定的外泌体进行捕获分离，然后再对目标外泌体的表面标志物及内容物（如携带的蛋白质、RNA、DNA及细胞因子）进行定量分析，从而更加全面地反映外泌体的特性。该技术在短短两年时间，备受广大科研工作者的关注。本文将为大家分享使用单外泌体表征分析技术与蛋白组学检测乏氧状态的肾细胞癌外泌体，以供参考。

图1 ExoView检测乏氧与正常RCC细胞外泌体表型

参考文献：[1] Samoylenko,   A., Kögler, M., Zhyvolozhnyi, A., Makieieva, O., Bart, G., Andoh, S. S., ...   & Hiltunen, J. (2021). Time-gated Raman spectroscopy and proteomics analyses of hypoxic and normoxic renal carcinoma extracellular vesicles.   Scientific reports, 11(1), 1-14.

详情请参考：https://qd-china.com/zh/news/detail/2110291415097

Cells：CD44糖蛋白在胃癌发生中的作用

CD44是一种跨膜糖蛋白，能够介导细胞间与细胞-基质间相互作用，主要配体为透明质酸（HA）。研究表明，CD44与肿瘤的生长相关，其在肿瘤细胞中高表达，且CD44与HA的结合亲和力高，因此纳米载体常用HA做表面修饰以作为肿瘤细胞的靶向药物载体。外泌体是天然的靶向信息传递载体，有研究在外泌体中检测到CD44。Härkönen等^[1]使用胃癌细胞MKN74研究了CD44表达对外泌体分泌，HA合成与肿瘤细胞生长的影响。结果表明，CD44促进了细胞表面和细胞间的HA形成，调控肿瘤微环境；CD44可改变外泌体的物理性质以及靶向性质。

其中，研究人员使用Exoview检测了MKN74细胞的未经纯化的培养基及分离纯化后的外泌体中的含CD44以及其他标记物的含量。结果表明，相对于对照组，MOCK（CD44敲除）细胞组在未经纯化的培养基及分离纯化后的分泌外泌体的数量显著降低。以上结果表示ExoView可以直接对复杂环境的培养基进行检测，无需分离纯化步骤，且检测结果具有特异性。

ExoView检测表达不同蛋白标记物的外泌体数量

参考文献：[1] Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio, H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

Cancer Cell Int：外泌体与miRNA调节成神经管细胞瘤的干细胞性

脑瘤中部分细胞具有干细胞特性，能够自我更新并分化为不同细胞系。其中，成神经管细胞瘤的病人有25%经过传统疗法后5年内复发并转移导致死亡，存活的病人也受到化疗和放疗的副作用和并发症影响，因此需要一种安全有效的治疗方法。肿瘤细胞的外泌体含有miRNA，能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程并与抗药性相关。有研究表明肿瘤干细胞的外泌体运载了肿瘤细胞特有的miRNA，能够产生有利于肿瘤发展的微环境。Choi等^[1]研究了成神经管细胞瘤的外泌体及运载的miRNA及其在肿瘤治疗中的潜在作用。其中，miR-135b和miR-13在肿瘤干细胞中高表达，抑制两者会导致具有肿瘤抑制作用的Angiomotin‑like 2（AMOTL2）表达上升，使肿瘤干细胞的干细胞特性下降。

其中，研究人员使用ExoView通过荧光成像检测肿瘤细胞与肿瘤干细胞的外泌体标记物，在两种细胞的外泌体上均检测到了Alix和Syntenin两种内蛋白，并且可以确定两种内蛋白与CD63/CD9外泌体标记物共定位。

Exoview检测外泌体上的Alix（a）与Syntenin（b）蛋白

参考文献：[1] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J. H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated miR-135b and-13 regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

Life：全新外泌体内容物检测技术助力治疗婴儿早产药物研发

外泌体内容物包含蛋白质、RNA、DNA和脂类，可被用于药物传递系统与疾病的新型诊断标志物，具有重要的研究意义。但传统的技术方法如Western Blot，ELISA，无法获得单个外泌体的蛋白表型，更不能将检测内容物与粒径分析、浓度分析、计数等联系起来，地制约了外泌体内容物的相关研究。单外泌体表征分析（Exoview）首先利用免疫识别将特定的外泌体进行捕获分离，然后再对目标外泌体的表面标志物及内容物（如携带的蛋白质、RNA、DNA及细胞因子）进行定量分析，从而更加全面地反映外泌体内容物的特性。近日，《Life》期刊刊登了Kammala等人的新研究成果，该团队使用全自动外泌体荧光检测分析系统 Exoview检测胎膜和胎盘外泌体的内容物，来研究母胎界面的药物转运。

研究组发现了CTC和BeWo细胞以外泌体内容物的形式转运BCRP。先前的研究发现，含CD63的外泌体可将跨膜蛋白转运管腔内囊泡中，而药物转运蛋白也是一种跨膜蛋白，可以被转运特定的组织发挥作用。胎膜细胞可通过含有BCRP的外泌体，以旁分泌的形式使其他细胞获得药物转运蛋白，影响特定组织的环境。通过这项新发现，改变现有的产科药理学，可以开发以BCRP+外泌体，尤其是CD63+/BCRP+的外泌体作为靶标的新型靶向药物，有效提高药物转运能力，降低早产的发生率，减轻孕期用药的不良反应，改善现有的孕期治疗方法。

图1 ExoView对CTC和BeWo细胞来源外泌体进行亚群计数分析

图2 ExoView对CTC和BeWo细胞来源外泌体进行多色荧光成像

参考文献：[1] Kammala,   A., Benson, M., Ganguly, E., Radnaa, E., Kechichian, T., Richardson, L.,   & Menon, R. (2022). Fetal Membranes Contribute to Drug Transport across   the Feto-Maternal Interface Utilizing the Breast Cancer Resistance Protein   (BCRP). Life, 12(2), 166.

详情请参考：https://qd-china.com/zh/news/detail/2204211043443

J of Extracellular Bio. ：ExoView直接检测房水中的极微量外泌体，助力小儿眼部疾病研究

小儿眼病的病情准确诊断与监测一直是临床上的一大难题，往往需要通过临床症状来评判。因此，小儿眼病的诊断评估急需新的分子诊断技术的帮助。房水是眼球眼房中，介于角膜和晶状体之间的无色透明水样液体，主要作用为屈光、为眼内组织提供营养和氧气、排出其代谢产物和维持眼内压。使用前房穿刺术可以安全地取出房水，作为液体活检样本用于诊断和监测眼病。 

研究表明，外泌体在视觉系统中可能有重要作用，如外泌体与青光眼和黄斑变性的病理生理相关。由于血-视网膜屏障存在，房水中的外泌体主要由眼内组织分泌，使得外泌体在眼病研究中更具有针对性。先前的研究中并未涉及房水外泌体的来源与分布，且由于技术手段的限制，今尚未将房水外泌体与小儿眼病联系起来。 

基于以上研究成果与客观需要，研究组获取了患有不同眼病，包含先天性白内障（CAT），先天性青光眼（GLC），小儿视网膜疾病（PRD）和视网膜母细胞瘤（Rb）的19个不同患者的房水样本，再将Rb患者根据治疗情况分为经过初步治疗（诊断+初步切除）（Rb_Tn）和经过主动治疗（二次切除+化疗）（Rb_Tx）两组，使用全自动外泌体荧光检测分析系统 ExoView的配套芯片，通过抗原抗体结合捕获了房水中的特异性外泌体，无需纯化，直接检测了房水中存在的不同亚群的外泌体的含量。

详情请参考：https://qd-china.com/zh/news/detail/2207051354219

bioRxiv：全自动外泌体荧光检测分析技术助力科学家开发出一种有效鼻腔新冠疫苗

新冠疫情爆发以来，多种不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、灭活病毒等)在全世界的抗疫中发挥了重大作用。然而现有的疫苗也有一些局限性，如储存运输条件苛刻、需要接种加强针、对突变病毒不敏感等等。近，bioRxiv发表了一篇基于细菌外泌体的新型新冠疫苗对疾病保护作用的文章，或许可以为新冠疫苗的研发提供新的思路。

Jiang和Driedonks等^[1]通过对细菌来源的外囊泡表面修饰病毒S蛋白的受体结合结构域（RBD）制成了新型新冠疫苗。革兰氏阴性菌能够产生外膜囊泡（OMV），在哺乳动物体内具有免疫刺激作用，可诱导免疫应答发生并激活树突细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞，而经过改造的工程菌产生的OMV内毒性非常低，避免了不良反应的发生。作者使用了一种鼠伤寒沙门氏菌株，通过Spycatcher/Spytag体系使该菌株分泌的OMV通过共价键稳定结合了病毒的RBD（图1）。

图1 （A）RBD重组抗原的设计，RBD连接到SpyTag的N端和C端；（B）RBD修饰的OMV示意图。

在这项研究中，作者使用Exoview系统对结合了重组RBD的OMV进行了表征分析，确定OMV上成功结合了新冠病毒的RBD。Exoview在外泌体疫苗开发中，可快速准确地表征外泌体，并统计不同表型外泌体数量并计算其比例，适合作为多组分外泌体疫苗的标准检测手段。

参考文献：[1]. Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman,   Wouter S.P. Jong, ... & Kenneth W. Witwer. (2021). A bacterial extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and Delta variant. bioRxiv. .

详情请参考：https://qd-china.com/zh/news/detail/2203041076411

Brain Behavior and Immunity：脊髓损伤导致血清神经炎症相关纳米颗粒中miRNA与CD81+外泌体水平的改变

脊髓损伤（SCI）会对机体产生系统性影响，导致呼吸、免疫、消化等功能异常，以及相关脑区产生神经炎症和退行性病变。有研究表明，SCI的病理与系统性影响可能与血液来源的因子如外泌体的运输有关；而在中枢神经系统损伤模型中，外泌体可能参与了miRNA等炎性因子运输导致炎症扩散。Khan等^[1]使用包括Exoview外泌体表型分析的多种技术详细表征了SCI建模的小鼠血浆外泌体，发现损伤后外泌体数量、蛋白marker和内容物均有明显的变化，将SCI小鼠的外泌体注射入脑室还可诱发产生炎症。

研究人员使用ExoView检测了SCI血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位（图1A）。外泌体在CD81和CD9区域产生特异性结合而被捕获，而没有CD63捕获。根据干涉成像获得外泌体尺寸分布，其中在50nm多（图1B&C）。荧光成像则检测到了大量干涉成像检测不出的尺寸小于50nm的外泌体（图1D&E），CD81和CD9在大量外泌体上表型出荧光共定位，而CD63荧光则未被检测到，这与图1C结果一致（图1F-H）。相比之下，NTA与流式分析无法检测到尺寸小于50nm的外泌体。

图1 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

研究人员进一步比较了SCI组和对照组的血浆外泌体变化，结果表明，在损伤后1d的时间点，CD81外泌体数量相对对照组更高，与Western Blot的结果一致；而CD9外泌体数量则没有统计学差异，与流式分析的结果一致（图2A&B）。基于图2H的CD81与CD9有大量的荧光共定位，检测CD9外泌体的CD81荧光强度，由1d的荧光强度中位数差异可知，

图2 ExoView检测血浆外泌体的粒径、数量、荧光强度和共定位

参考文献：[1] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2020). Spinal cord injury alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and immunity.

Cell：对不同体液中小RNA测序以筛选胞外RNA提取方法

exRNA profile会受到不同来源（细胞/组织），不同状态（年龄/健康程度/器官状态）的影响，且由包括外泌体在内的不同的载体运输，加上不同的提取方法和检测技术，均会影响exRNA profile的测定结果。现今的小RNA测序方法已经可以准确地表征exRNA profile，因此合适的exRNA提取方法便关重要。Srinivasan^[1]等通过使用多种exRNA分离方法分离不同位点获得的5种体液中的外泌体，分析结果后总结出了不同体液的适合分离方法。

其中，研究人员使用单个外泌体表型分析技术(Exoview)检测了来源于人血浆的外泌体的蛋白marker表达，判断出血浆外泌体根据蛋白marker主要分为CD63-/CD81+/CD9+和CD63+/CD81+/CD9+两种。

人血浆外泌体蛋白表达分析

参考文献：[1] Srinivasan, S., Yeri, A., Cheah, P. S., Chung, A., Danielson, K., De Hoff, P., ... & Laurent, L. C. (2019). Small RNA sequencing across diverse biofluids identifies optimal methods for exRNA isolation. Cell, 177(2), 446-462.

Journal of Extracellular Vesicle：四跨膜蛋白区分人血清和血浆中不同的外泌体亚群-血浆样品中血小板外泌体的贡献

早期研究证明从血液中分离外泌体的能力对于将外泌体开发为疾病的生物标志物至关重要，尤其是从血浆和血清中分离外泌体，但很少有研究系统地比较这些来源的外泌体类型。Nasibeh Karimi等[1]对确定血浆和血清中不同外泌体亚群的存在进行了研究。研究人员采集健康受试者血液，分别用 K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血浆，同时用血清凝块激活剂管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和质谱等技术分析分离出的外泌体亚群。结果表明人类血液中含有多个携带不同四跨膜蛋白的外泌体亚群，使用不同的抗凝剂和离心方法，会影响外泌体亚群的分析。

其中，研究人员使用ExoView对从血浆（EDTA）、血清以及人肥大细胞系分离的外泌体进行检测，结果显示在血浆和血清的样本中，血小板蛋白CD41a抗体捕获最多的是CD9+外泌体。与血清相比，血浆中的CD9+外泌体更多，并且是从血小板释放的（图1 a,b,c），然而血清中的CD63+/CD41a+外泌体的数量高于血浆（EDTA）（图1 m,n），这与之前的磁珠ELISA法的结果保持一致。另外，在血浆、血清样本中，被CD81抗体捕获的外泌体的CD63+比例较低，而CD9+比例较高（图1 a,b,d,e,g,h），进一步验证了早先的研究结果，但是在人类肥大细胞系的样本中，研究人员没有观察到这种差异（图1 c,f,i,l）。另一方面，粒径分析的结果显示CD41a和CD9抗体捕获的外泌体的粒径相对较小，表明捕获的外泌体是单外泌体，而不是外泌体聚合物（图1 o）。

图1 ExoView检测从血浆、血清、人肥大细胞系分离的外泌体的数量、共定位和粒径

参考文献：[1] Nasibeh Karimi, Razieh Dalirfardouei, Tomás Dias, Jan Lötvall, Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.

Journal of Extracellular Vesicle：光诱导免疫功能外泌体的高效产生

基于外泌体的治疗方法和疫苗正在不断兴起，然而基于临床应用剂量规模的研发始终是一个巨大的瓶颈。为了克服这样的障碍，Shaobo Ruan^[1]等开发了一种简单直接的方法，通过利用近紫外LED灯（365nm）的光感应来促进树突状细胞分泌外泌体 (DEV)。体外和体内实验的结果显示，近紫外波长不会损害细胞生长，使DEV生产率提高了13倍以上，同时让DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成为理想的治疗平台。

其中，研究人员使用ExoView对DEV的免疫性标记物进行检测，把样品组分为未处理的成熟树突状细胞来源的外泌体（mDEVs）、未处理的未成熟树突状细胞来源的外泌体（imDEVs）、近紫外光照射的成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-mDEVs）、近紫外光照射的未成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-imDEVs）。结果证明光诱导对DEV的免疫标记表达几乎没有影响。在 DEV上保留必要的免疫标志物对于免疫反应至关重要。

图1 ExoView检测mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性标记物的数量、共定位以及进行荧光成像

参考文献：[1] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12194. 

medRxiv：肺泡灌洗液（BAL）中的CD14+外泌体或可作为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）病情严重的判断新指标

近期有研究表明，外泌体的促炎作用与ARDS的发病相关。肺部受大肠杆菌侵染后分泌的外泌体能够诱发肺部产生炎症反应；而在小鼠肺部损伤建模实验中，含有miRNA内容物（如miR-466）的外泌体能够促进肺泡巨噬细胞分泌炎性因子。还有研究表明，肺泡灌洗液中CD14+的外泌体可能作为慢阻肺COPD的病情活动指标。在本研究中，作者使用Exoview系统对肺泡灌洗液（BAL）中的外泌体进行了表征分析，并且对不同来源的外泌体进行了统计，结果发现CD14+外泌体或可作为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）病情严重的判断新指标，为临床上预防或治疗ARDS提供了新的线索。

参考文献：[1] Mahida, R. Y., Price, J., Lugg, S. T., Li, H., Parekh, D., Scott, A., ... & Thickett, D. R. (2021). CD14 Positive Extracellular Vesicles in Broncho-Alveolar Lavage Fluid as a New Biomarker of Acute Respiratory Distress Syndrome. medRxiv.

详情请参考：https://qd-china.com/zh/news/detail/2112301135692