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高水平文献导读丨单外泌体表型分析技术助力干细胞研究

发布日期:2021-02-23

近几十年来,在再生医学领域,生物制剂的应用经历了飞速的发展。在生物制剂中,干细胞正逐渐成为重要的研究对象。研究表明,干细胞的治疗作用可能通过旁分泌作用实现,外泌体作为细胞旁分泌的一种生物活性物质,成为近年来的研究热点。


单外泌体表型分析是将免疫学与光学成像完美结合的一种新技术[1]。该技术首先利用免疫特异性结合将特定的外泌体进行捕获分离,然后再对目标外泌体的尺寸、分布、表面标志物及内容物(如携带的蛋白质、RNA、DNA及细胞因子)进行定量分析,从而更加全面地反映外泌体的特性。单个外泌体表型分析技术在短短两年时间,备受广大科研工作者的关注。本文收集了该技术在干细胞领域的相关应用,供您参考。


International   Journal of Molecular Sciences:含外泌体的干细胞提取物可促进组织再生

 

间充质干细胞(MSC)能够分泌具有生物活性的分子如生长因子,细胞因子和外泌体,其中外泌体能够调控其它细胞,在受损伤组织处产生再生性微环境,是MSC生理功能的载体。外泌体可作为无细胞的再生治疗方法,相比于细胞治疗具有更高的安全性,更低的免疫原性,不会诱发形成肿瘤,且尺寸较小,更容易迁移至靶点。Gupta等[2]发现通过培养MSC获得的含生长因子,细胞因子和外泌体的提取物能够促进细胞增殖及诱导干细胞迁移以修复受损组织。联系之前的研究成果,这些因子共同作用的结果可应用于再生治疗方法的开发。


其中,研究人员使用纳米粒子追踪(NTA)法检测了提取物中纳米颗粒的浓度和外泌体的总浓度,并用ExoView同时检测了提取物中含不同蛋白标记物的外泌体的浓度、尺寸。结果可知,ExoView直接获得了不同种类外泌体的浓度(图1B)以及详细的尺寸分布,众数与均值(图1C&D)。通过ExoView法还发现提取物中并没有含CD63的外泌体。

 

图1 A,NTA法检测的提取物中纳米颗粒浓度与外泌体浓度;

B,ExoView检测的CD81和CD9外泌体浓度;

C,ExoView检测的CD81和CD9外泌体尺寸分布;

D,ExoView检测的CD81和CD9外泌体尺寸众数与均值。

 

Cancer Cell Int:外泌体与miRNA调节成神经管细胞瘤的干细胞性

 

脑瘤中的部分细胞具有干细胞特性,能够自我更新并分化为不同细胞系。其中,成神经管细胞瘤的病人有25%经过传统疗法后5年内复发并转移导致死亡,存活的病人也受到化疗和放疗的副作用和并发症影响,因此需要一种安全有效的治疗方法。肿瘤细胞的外泌体含有miRNA,能够调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程并与抗药性相关。有研究表明肿瘤干细胞的外泌体运载了肿瘤细胞特有的miRNA,能够产生有利于肿瘤发展的微环境。Choi等[3]研究了成神经管细胞瘤的外泌体及运载的miRNA及其在肿瘤治疗中的潜在作用。其中,miR-135b和miR-135a在肿瘤干细胞中高表达,抑制两者会导致具有肿瘤抑制作用的Angiomotin‑like 2(AMOTL2)表达上升,使肿瘤干细胞的干细胞特性下降。


其中,研究人员使用ExoView通过荧光成像检测肿瘤细胞与肿瘤干细胞的外泌体标记物,在两种细胞的外泌体上均检测到了Alix和Syntenin两种膜内蛋白,并且可以确定两种膜内蛋白与CD63/CD9外泌体标记物共定位(图2)。


图2 Exoview检测外泌体上的Alix(a)与Syntenin(b)蛋白

 

Cells:诱导性多能干细胞外泌体在急性肾损伤中的保护作用

 

骨髓干细胞(MSC)具有治疗急性肾损伤的作用,促进肾小管上皮细胞的增殖并抑制细胞凋亡,且MSC分泌的外泌体也有相似的作用。研究发现,诱导性多能干细胞(iPSC)具有抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡,在其他肾损伤模型中起保护作用,且iPSC也可以分泌有心脏保护作用的外泌体。于是,Collino等[4]研究了iPSC外泌体在急性肾损伤中的作用。结果表明,iPSC外泌体在肾损伤模型中表现出保护作用,主要体现于保护线粒体、降低氧化应激与抗炎三个方面。


其中,研究人员使用ExoView检测了含有不同蛋白标记物的iPSC外泌体的尺寸并统计了所有外泌体的尺寸分布。其中,含有CD81/CD63/CD9的外泌体直径主要分布于50-110nm,CD44外泌体直径主要分布于55-85nm(图3)。


图3 iPSC外泌体的尺寸分布

 

Nanoscale:温敏水凝胶包被干细胞外泌体对术后肠痿的治疗作用

 

干细胞外泌体用于治疗,若采用全身给药,往往会被单核巨噬细胞清除导致外泌体到达患处的数量降低,影响治疗效果。Berger 等[5]采用了一种温敏水凝胶(Pluronic F-127 (PF-127),poly (N-isopropylacrylamide))包被干细胞外泌体,通过表皮穿刺给药来确认外泌体对术后肠痿的治疗作用。相对于含外泌体的生理盐水的静脉注射/穿刺给药,水凝胶穿刺给药的外泌体更容易到达并停留在患处,且治疗效果更好。


在凝胶包被前,研究人员使用Exoview检测了的制备的外泌体表面的蛋白标记物,确认外泌体表面含有CD81和CD63,而含CD9外泌体较少(图4A);进一步使用荧光成像可以确认外泌体不含Calnexin(外泌体的阴性标记),表示外泌体未被污染(图4B)。


图4 ExoView检测外泌体蛋白标记物(A)与外泌体是否被污染(B)

 

综上所述,Exoview作为新一代的外泌体表征系统,不仅能够胜任传统外泌体表征系统的工作完成对外泌体的尺寸和分布进行统计,并且能够将这种统计细化提供不同亚型外泌体之间分布及其表型的区别。提供更为详实的外泌体研究数据,帮助研究者更好的研究干细胞来源的外泌体在心血管系统、外伤性脑损伤、肌肉骨骼系统、肾损伤等方面的强大修复再生和保护能力,阐明其中的机理。为再生医学治疗的提供一种全新的分析手段。

 

参考文献:

 

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb, J., Sevenler, D.,   Fawcett, H., Goldberg, B., ... & Ünlü, M. S. (2016). Real-time capture and visualization of   individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2), 2827-2833.

[2] Gupta, A., Cady, C., Fauser, A. M., Rodriguez, H. C.,   Mistovich, R. J., Potty, A. G., & Maffulli, N. (2020). Cell-free Stem   Cell-Derived Extract Formulation for Regenerative Medicine Applications.   International Journal of Molecular Sciences, 21(24), 9364.

[3] Choi, S. A., Koh, E. J., Kim, R. N., Byun, J. W., Phi, J.   H., Yang, J., ... & Kim, S. K. (2020). Extracellular vesicle-associated   miR-135b and-135a regulate stemness in Group 4 medulloblastoma cells by   targeting angiomotin-like 2. Cancer cell international, 20(1), 1-14.

[4] Collino, F., Lopes, J. A., Tapparo, M., Tortelote, G. G.,   Kasai-Brunswick, T. H., Lopes, G., ... & Lindoso, R. S. (2020).   Extracellular vesicles derived from induced pluripotent stem cells promote   renoprotection in acute kidney injury model. Cells, 9(2), 453.

[5] Berger, A., Araújo-Filho, I., Piffoux, M., Nicolás-Boluda,   A., Grangier, A., Boucenna, I., ... & Silva, A. K. (2021). Local administration   of stem cell-derived extracellular vesicles in a thermoresponsive hydrogel   promotes a pro-healing effect in a rat model of colo-cutaneous post-surgical   fistula. Nanoscale, 13(1), 218-232.

 

   

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