人诱导多能干细胞（hiPSCs）敲除/单核苷酸多态性（SNP）敲入的优化CRISPR实验方案

本文提出了一种优化CRISPR-Cas9方案，用于在人类诱导多能干细胞（hiPSCs）中高效实现基因敲除（KO）或单核苷酸多态性（SNP）敲入（KI）。该流程整合了基因组靶向设计、CRISPR递送、编辑效率评估和自动化单细胞克隆分离技术，显著提高了基因编辑的成功率和克隆存活率。研究人员采用isoCell自动化平台进行单细胞克隆分离，显著提升了克隆筛选的效率和准确性。

完成转染的hiPSCs经过编辑效率验证后，使用isoCell进行单细胞克隆分选。以下步骤描述的是针对一个细胞克隆GRID（包含256个独立腔室）的接种过程，预期细胞克隆存活率不低于40%。

采用isoCell优化的细胞克隆方法，在256个腔室的GRID中，接种当天可计数到平均70个含有单细胞的小室（图A），其中平均有46个克隆存活，存活率可达65%。对于22种不同的iPSC细胞系的32个基因位点的KO score和KI score评分，最低的评分分别为15和10（图B）。但由于相对较高的克隆效率，一块GRID也能够获得多达5个克隆。

参考文献：

Ludwik, K. A., Telugu, N., Schommer, S., Stachelscheid, H., & Diecke, S. (2023). ASSURED-optimized CRISPR protocol for knockout/SNP knockin in hiPSCs. STAR protocols, 4(3), 102406.

《Cell》胶质母细胞瘤（GBM）通过表观遗传免疫编辑获得骨髓相关转录程序以引发免疫逃逸

胶质母细胞瘤（GBM）在基因组、转录组和表观遗传层面上表现出高度的肿瘤内和肿瘤间异质性。GBM与肿瘤免疫微环境之间的相互作用在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。然而，GBM如何促进肿瘤免疫微环境的机制仍然不清楚。英国爱丁堡大学再生医学中心的Steven M. Pollard团队^[1]通过体外试验和动物模型发现，胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cell, GSC）通过表观遗传途径进行免疫编辑，促进髓系细胞的招募，形成富含髓系细胞的肿瘤微环境，从而实现免疫逃逸并促进肿瘤进展。

本文中研究者使用iotaSciences的单细胞可视化分选培养系统isoCell分选并培养了NPE-IE Irf8敲除细胞，随后构建了相应的细胞系。NPE-IE Irf8敲除细胞系的肿瘤发展动力学与移植了NPE-IE细胞的小鼠相似，证明Irf8的激活是NPE-IE细胞免疫逃逸的重要因素，并且这种激活可能通过体内的IFNγ信号介导。

这项研究揭示了GBM细胞在受到免疫攻击后，通过表观遗传重组和髓系特异性转录因子的表达，增强TME的免疫抑制性，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。这为监测免疫治疗过程中GBM细胞的免疫逃逸及制定新的免疫治疗策略提供了新的思路，对于在GBM中发现的表观遗传免疫编辑过程是否也适用于其他脑瘤或癌症，将具有重要意义。

参考文献：

[1]. Gangoso,   E., Southgate, B., Bradley, L., Rus, S., Galvez-Cancino, F., McGivern, N.,   ... & Pollard, S. M. (2021). Glioblastomas acquire myeloid-affiliated   transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune   evasion. Cell, 184(9), 2454-2470.

人类诱导多能干细胞(hiPSCs)的单细胞克隆

人类诱导多能干细胞(hiPSCs)构建单克隆细胞系培养步骤繁琐，细胞对异常的处理和操作非常敏感，传统单细胞分选容易导致细胞和遗传毒性应激的积累，进而导致不良分化和多能性丧失。使用isoCell可以温和且自动化地将人类诱导多能干细胞(hiPSCs)进行单细胞分选，并高效地培养hiPSCs单克隆细胞系，显著提高了细胞分离与克隆效率（如下图所示）。

K562细胞单细胞测序

传统单细胞测序需对单细胞进行全基因组扩增（WGA），但传统单细胞WGA受限于如何获得单个细胞并转移到小体积的WGA反应中。

使用isoCell自动将K562细胞拾取并转移至含3.5 µl scWGA试剂的PCR管中，并无缝衔接scWGA反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示（下图），单细胞WGA的DNA样本(+)中两种基因均被特异性扩增，而阴性对照(-)没有这两种扩增产物，符合预期。

对人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) Prime 编辑构建工程细胞系

Prime 编辑可在 HEK3 基因座中高效精确插入三个核苷酸，用于构建工程细胞系hiPSCs。通过引入靶标特异性 pegRNA 来编辑单个或多个基因组位点，以进行精确有效的基因组编辑，促进疾病建模和功能遗传学研究。

Prime 编辑使用与逆转录酶融合的 Cas9 切口酶，将 DNA 序列从“Prime 编辑”引导 RNA (pegRNA) 复制到特定基因座。通过Prime 编辑将多西环素诱导型 Prime Editor 蛋白 (PE2) 整合到 iPSC 细胞系的AAVS1 基因组，之后使用isoCell分选转入靶基因的hiPSCs细胞系，以确保细胞的单克隆性。（见上图）

该研究使用isoCell来确保工程细胞系的单克隆性与准确性。 

参考文献：

Bharucha N, Ataam J A, Gavidia A A, et al. Generation of AAVS1 integrated doxycycline-inducible CRISPR-Prime Editor human induced pluripotent stem cell line[J]. Stem Cell Research, 2021, 57: 102610.

1. Fahy, K., Kapishnikov, S., Donnellan, M., McEnroe, T., O'Reilly, F., Fyans, W., & Sheridan, P. (2024). Laboratory based correlative cryo-soft X-ray tomography and cryo-fluorescence microscopy. Correlative Light and Electron Microscopy V, 293.

2. Fahy, K., Weinhardt, V., Vihinen-Ranta, M., Fletcher, N., Skoko, D., Pereiro, E., ... & McEnroe, T. (2021). Compact Cell Imaging Device (CoCID) provides insights into the cellular origins of viral infections. JPhys Photonics, 3(3).

3. Kapishnikov, S., Hempelmann, E., Elbaum, M., Als‐Nielsen, J., & Leiserowitz, L. (2021). Malaria pigment crystals: The achilles′ heel of the malaria parasite. ChemMedChem, 16(10), 1515-1532.

4. Kapishnikov, S., Staalsø, T., Yang, Y., Lee, J., Perez-Berna, A. J., Pereiro, E., ... & Als-Nielsen, J. (2019). Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(46), 22946-22952.

5. Kapishnikov, S., Leiserowitz, L., Yang, Y., Cloetens, P., Pereiro, E., Awamu Ndonglack, F., ... & Als-Nielsen, J. (2017). Biochemistry of malaria parasite infected red blood cells by X-ray microscopy. Scientific reports, 7(1), 802.

单细胞可视化分选培养系统—isoCell.pdf

isoCell——全自动单细胞分离-培养-收获