—— 一款全自动高精度单细胞操纵平台
瑞士Cytosurge公司推出的多功能单细胞显微操作系统——FluidFM OMNIUM，是一款将原子力系统、显微成像系统、微流控系统、活细胞培养系统融为一体的单细胞显微操作平台，其核心技术——FluidFM技术采用了纳米级中空探针，轻松实现单个细胞水平、fL级别超高精度、全自动化的细胞操作。
FluidFM技术打开了传统细胞实验手段无法触及领域的大门，突破了单细胞研究、药物开发、细胞系开发中的障碍，主要功能包括单细胞提取、单细胞分离、单细胞注射、单细胞力谱等。深度应用于CRISPR基因组编辑、单克隆细胞系开发、病毒学、神经科学和生物力学等领域。
原子力与微流控技术的结合，能够实现对单细胞可视化、全自动、高速度、低伤害的操纵，可用于单细胞注射、单细胞提取、单细胞分选、单细胞粘附力的测定#
单细胞提取
——FluidFM技术是极微量、低创、精准的活细胞原位提取方案
直接细胞自然生长环境中提取单个细胞的内容物，同时不影响细胞活力。该程序是破坏性的，实验证明，可以在不同时间点对同一单个细胞进行细胞活组织检查。
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单细胞分离
——FluidFM技术是进行无损细胞分离、分选、构建细胞系的理想工具
直观、简单、温和、自动化；
精确的挑选和放置细胞：选择你想要的细胞，并把它放在您需要的位置
分离通量：约50个细胞/小时。
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可以将分离后的细胞放置任何您需要的位置，也可以按照不同的形状位置去放置细胞。
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■ 单个细胞级别的分离和转移
在当代生物学与医学的研究中，对单个细胞的分离一直有着很高的需求。然而传统手段往往需要将大量细胞悬浮后进行分选接种。这类方法不仅费时费力，而且细胞活力也会受到影响。本篇报道中Guillaume使用FluidFM OMNIUM建立了一种非常简易、快速的新手段。
单细胞分离有哪些优势？
由于蛋白和基因的随机表达性，即使同一基因源的细胞也可能会有所不同。因此单细胞分离对于克服细胞异质性有着十分重要的意义。能够让研究者从一群混合细胞群中挑选特定感兴趣的细胞，之后既可以用于单细胞分析，也可以用于单克隆扩增。这种检测手段能够检测到常规细胞检测手段所不能发现的细胞群中的多样性。
另外对于细胞转染、感染、注射的实验来说，选取单个细胞对于建立特定基因或表达特定蛋白的克隆来说更是十分必要的。因为只有单一基因的细胞群才能大限度的保持种群稳定。
在目前的研究中，分离单细胞的手段主要是通过将细胞悬浮后做高通量筛选。其中主要使用的是流式细胞荧光分选技术（FACS）或者免疫磁性细胞分选法（MACS）。这两种方法在临床上目前均广泛应于细胞筛选。然而这两种方法均需要使用相当大量数量的细胞，一般在105-106数量级上。然而很多研究中，培养出的细胞不太容易达到这个数量级。而在少量细胞分选中，这两种方法均面临着地挑战。
FluidFM分离方法
流体力学显微镜（FluidFM）是将微量注射与原子力显微镜技术相结合的新一代单细胞操作显微镜。它能够在细胞表面实现精准的移动和fL级的流体移动控制。因此在技术层面上拥有非常优越的单细胞操纵能力。
Guillaume等首先对FluidFM对单细胞喷洒胰酶的消化能力进行了考察。他们将胰酶喷洒在细胞上方，再观测细胞消化程度随时间的变化。通过他们的研究，他们研究了压力与淋撒体积之间的关系、胰酶作用时间与消化范围之间的关系、胰酶淋撒压力与消化面积之间的关系如图1所示。
图1，胰酶释放控制对细胞消化的影响。A）胰酶释放两样与压力脉冲参数之间的关系；B）胰酶作用时间与消化细胞面积之间的关系（200mbar，10s）；C）细胞消化面积与时间之间的关系（200mbar，10s）；D）终消化面积与施加压力的对应关系。
之后他们尝试对单个Hela细胞进行了消化，通过对压力和作用时间的控制，可做到仅将目标细胞分离但不对周围任何细胞产生影响，如图2所示。
图2 单个细胞可控消化 A）将HeLa种在载玻片并对其中一个细胞进行了mRFP-actin转染，在RFP下显示红色荧光。B）在细胞表面喷洒胰酶消化；C）观测到细胞成功消化。
随后他们对含有mRFP-actin的Hela从大量Hela细胞中进行了分离，并取得了成功，如图3A。为了一进步验证这种方法的可靠性，他们再次对这个细胞新型一次消化并转移，细胞仍然存活，如图3B所示。之后他们用这种方法对普通HeLa细胞进行了分离，并且观察了它们的存活状态如图3C-E所示，测定存活率可高达97%。
图3 单细胞分离 A）对含有mRFP-actin的细胞从HeLa细胞群分离；B）对单个mRFP-actin HeLa细胞进行分离；C-E）对分离后的HeLa细胞进行了FDA/PI染色。并种在三种不同的微孔板中。
（红色为死亡细胞，绿色为存活细胞）
使用FluidFM分选细胞
而对于悬浮细胞的分选工作，FluidFM也能够轻松应对。首先Guillaume对单个细胞进行了转移实验。经过实验发现以ΔP = -100 mbar条件对细胞进行吸取，即可将细胞吸入移液枪中。随后将探针转移新的微孔中再以ΔP = +1000 mbar作用1-2s即可将细胞吐出。在之后的培养中也可观测到细胞贴壁生长，说明这种分选对细胞没有损伤，如图4A所示。
而后他们对细胞进行了连续分选，将形态相似的细胞放入同一小室，如图4B所示。以及根据荧光标记不同分别放入不同小室，如图4C所示。使用这种方法分选一样简单可靠。
图4 细胞分选 A）对活细胞进行分选并记录图像。在分选后1小时，细胞开始贴壁生长；B）连续对细胞进行分选，并放置到同一个小孔中。C）根据染色标记将不同染色的细胞分类放置在不同小室中。
总结
FluidFM是一种强大的分离单细胞的强大手段，通过使用光学手段甄选出感兴趣的细胞后，就能够使用FluidFM技术对其分离，并且不会对细胞造成损伤，能够保证所分离的细胞大限度的存活。这种方法的应用将会给生物和医学研究提供地帮助，尤其对于单克隆细胞群的建立或单细胞的下游分析。
■ 单个细胞级别的粘附力测定
单细粘附力的测定一直以来都缺乏一种能够在不改变细胞性质的同时测量细胞整体粘附力的设备。现如今FluidFM 技术的出现改变了这一状况。高精密的流体力探针能够在精准感知压力的同时通过内压而非蛋白结合的方式在不改变细胞性质的同时牢固的抓取细胞，为单细胞粘附力测定提供新的可能。
Cytosurge 推出的全新的FluidFM 技术给粘附力测量带来了新的希望。这种技术结合了前沿的原子力显微镜探测技术与微流体控制系统。该技术能够直接通过使用中空的原子力探针将细胞通过负压粘附在探针表面，并不需要激活细胞的任何通路信号。这样为粘附力的测量带来了的优势。一方面，这种方法能够提供远比蛋白结合牢固多的粘附力，能够将细胞牢固的固定在探针上面，因此能够用于直接从基质上分离。而另一方面，由于没有生物处理，这种方法不会改变任何细胞表面的通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。本文就如何使用FluidFM 测定细胞粘附力和近期应用案例进行总结。
FluidFM 技术如何测定细胞粘附力？
为了阐述这个问题，本文引用Scientific Reports 在2017 年发表的文献中的方法进行阐述。众所周知，细胞在基质上进行单层培养时，吸附在基质表面时主要会产生两种不同类型的力，一种是细胞与基质之间的粘附力，另一种是细胞与细胞之间的粘附力。因此对于细胞粘附力来说，单个细胞的粘附力就是细胞与基质之间的作用力。而单层细胞的细胞粘附力则是细胞之间相互作用力和细胞基质与细胞之间作用力之和。如下图所示：
因此只要同时测定单个细胞粘附力即可得到细胞与基质之间的相互作用力，而细胞间的相互作用力则可以通过同时测量单层细胞的细胞粘附力和单个细胞的粘附力做差即可得到，如下公式所示：
Force cell-cell ≌ Force Monolayer – Force Indiv.cell
以上即为粘附力的计算方法，为了能够测量粘附力Sancho 等使用FluidFM 技术，通过将探针靠近细胞直到探针与细胞接触，之后开始对探针腔内增加负压从而牢固的吸住细胞。当细胞固定后收回探针并记录这之间的力学变化，如下图所示：
从图中显示出当探针开始靠近细胞后，探针表面开始出现压力变化，如上图中的蓝色区域所示。当出现这种变化后就停止下降探针并开始施加负压。这时候由于腔内负压，探针和细胞之间的结合变得紧密，导致探针被细胞向下拉动，从而产生了上边右图白色区域的力学变化。随后随着探针上升，细胞给以探针的拉力随之增高，并逐渐达到临界，使得细胞脱离基质。这一过程的大值即为细胞粘附力。
FluidFM 测定细胞粘附力的应用：
● Cohen 等使用FluidFM 技术对MCF7-MCF10A、MCF7-HS5 的细胞粘附力进行了测定，并与以往的文献进行对比，发现其数据与Hossein 等测定的结果相符。如下图所示：
使用FluidFM 技术对MCF7-MCF10A、MCF7-HS5 细胞粘附力进行测定 a. 使用FluidFM 测定细胞粘附力全过程；b. MCF7-HS5 的细胞粘附力测试结果；c. MCF7-MCF10A 的细胞粘附力测试结果。
● aatinen 等通过使用FluidFM 技术研究外加电流对C2C12 小鼠成肌细胞粘附力的影响中发现随着外周电流的增加，细胞形态发生改变，与基质接触面积降低。当电流剂量高过11As/m2后细胞形态急剧改变，粘附力等参数发生明显变化，甚死亡。如下图所示：
FluidFM 测定C2C12 细胞粘附力 a.使用FluidFM 测定粘附力显微镜图；b.施加12.3As/m2电流和空白对照组的粘附力谱线；c.粘附力与电流之间的量效关系图。
● Sankaran 等使用FluidFM 来研究共价和非共价的表面整合素受体对细胞粘附力的影响。通过测定发现两者均可有效增加细胞的粘附能力，并且效果近似。
使用FluidFM 技术测定共价键与非共价键之间的整合素受体RGD 之间的区别 a. FluidFM 测定粘附力的示意图； b. 细胞粘附力测定前后显微镜示意图； c.测定粘附力时候的力学曲线图；d. 大粘附力图。
● Sancho 等通过FluidFM 技术使用了一种非常有趣的测量方法来测量MSX1 过表达对细胞骨架的影响，他们首先将10μm 的小胶球固定在探针上，之后使用探针去压细胞直到探针压力达到2 nN，通过压痕曲线来分析细胞骨架变化。通过对比发现过量表达MSX1 细胞的硬度显著比普通细胞高。如下图所示：
使用FluidFM 技术测定HUAEC 中MSX1 过表达对细胞骨架的影响。a. HUAEC 细胞的免疫荧光染色phalloidin（上）、vimentin（下）（绿色）Hoechst（蓝色）；b. HUAEC 细胞的免疫荧光染色phalloidin（红色）、vinculin（绿色）TOPRO-3（蓝色）；c. 每个克隆中vinculin 阳性面积；d. 使用FluidFM 技术压细胞的示意图；e. 吸取10μm 珠子；f. 空白细胞下压时的力学谱线；g. MSX 过表达细胞下压时的力学谱线，更深的凹陷和平滑的斜率表示较低的刚度； h.用胶体压痕法测定细胞刚度的测量结果。
总结
细胞粘附力测定在细胞生命科学研究中起着关重要的作用，然而传统手段中有着各种各样的局限性，这主要原因是缺乏一种有效能够抓取细胞并进行力学测定的手段。现如今FluidFM 技术在细胞粘附力测定中的使用，使得研究者们有了一种能够有效、低损的方式抓取细胞，并配合着原子力显微镜的精确测量的特性，从而能够真正意义上的做到精准、无损、快速的测量单细胞粘附力，帮助研究者寻找细胞粘附力与细胞生命发展、肿瘤细胞转移之间的关系。
■ 单个细胞级别的活细胞提取及应用
由于细胞异质性的存在，单细胞层面的分析就变得十分重要。目前对于单细胞分析的方法主要还是通过化学、生物学的方法进行裂解后，提取内容物进行分析，然而这种方法往往会对样本造成一些损伤。直接提取活细胞具有诸多优点，但是操作困难。如今一种全新使用FluidFM 科技的技术新报道有望提供一种活细胞提取新型的简易方法。
使用FluidFM 设备提取细胞并不会影响细胞活力
在本文中，作者对首先建立了一种使用FluidFM 提取细胞的方法。他们尝试了各种提取量以确定使用FluidFM 能够对细胞提取的大量。在实验中他们发现使用FluidFM 抽取4 pL的细胞质并观测，发现82%的细胞依然存活，如图1B 所示。但是如果将抽取量加大到4.5 pL则无细胞能够存活。而对细胞核而言抽取0.6 pL 后，有86%的细胞依旧存活，如图1A。而在0.7 pL 或以上的体积提取则不可避免的导致细胞死亡，如图1B 所示。随后他们对提取后细胞的存活状况进行了考察。而后他们继续对提取过的细胞进行观察，结果发现这些细胞的功能并没有受到影响。细胞能够在提取后约30 小时后正常分裂，如图1E 所示。因此作者认为使用FluidFM 提取的大量为细胞核0.6 pL 和细胞质4pL。
图1：细胞存活率检测 A)原生细胞的体积分布图，虚线为平均值，点线为大值和小值；B)细胞提取体积与活细胞数之间的关系。C)活细胞细胞核提取后GFP 的变化；D)死细胞细胞核提取后GFP 的变化；E)活细胞提取后（2.9 pL）后对细胞形态的连续观测。
使用FluidFM 单细胞提取物的三种应用
1.透射电镜负染色观测
对于细胞亚结构的观察，往往对于揭示细胞病变有着重要的意义。然而细胞裂解的传统手段往往会产生大量的碎片，因此对细胞器的观察造成了诸多困难。在本篇报道中，作者通过使用FluidFM 设备提取细胞内容物，在低温环境下转移到透射电镜的铜网上，然后进行负染色和挥干，之后将片子放到透射电镜下观察，并使用传统裂解方法得到单细胞溶液同时铺设在铜网上进行对比。通过观察他们发现，使用FluidFM 技术得到的细胞提取物能够观察到大泡状的结构、小球状的结构和长丝类的结构，如图2C 所示。而相比之下细胞裂解法得到的结果却不尽人意，如图2D 所示。
图2：细胞提取物负染色电镜图 A)电镜样本制作的示意图；B)提取液滴在电镜铜网上的放大图；C)FluidFM 技术的细胞提取物电镜下的图像；D)普通裂解法的细胞提取物电镜下的图像。
2. 酶活力的检测
酶活力的检测对于探寻细胞异质性有着十分重要的意义。因此作者也对FluidFM 提取的细胞提取物进行了对比。首先作者通过β-半乳糖苷酶实验来测定提取蛋白的完整性。通过测定酶解底物产生的荧光素的荧光强度，他们成功观察到荧光强度随时间而增加，说明提取物中的蛋白没有被破坏，如图3C、D 所示。随后作者又对不同细胞进行了不同酶活力的检验，结果显示无论是LacZ 转基因HeLa 细胞上还是在测定HeLa 细胞的Caspase3 酶上均取得了成功，如图3 E、F 所示。
图3：酶活性分析 A)细胞提取分析的示意图；B)将提取的3 pL 细胞提取物放到预先液封的微孔中；C)酶解底物产生荧光素的荧光强度变化，荧光在1 小时后可见。D)图形量化荧光强度时间表；E)LacZ 转基因细胞和非转基因细胞之间β-半乳糖苷酶活性的差异；F）Caspase3 酶活力测定。
3.单细胞级转录检测
单细胞层面的基因表达通常需要反转录或者PCR 扩增，之后使用qPCR 测定。而在此之前往往需要将细胞裂解，而作者他们采用了与传统方法不同的策略。他们首先创建了使用FluidFM 直接从活细胞中提取大约0.01 pg RNA，并用普通PCR 管合成cDNA 并进行qPCR 检测，如图4A 所示。由于如此小的提取量是不能直接放到PCR 管里面的，所以他们采取的策略是首先将提取液注入1uL 水中，然后再转移到PCR 管中，进行合成和检测如图6B 所示。他们检测了两种管家基因beta-actin (ACTB)beta-2-microglobulin (B2M)以及GFP mRNA 的表达量。在21 个样本中有90%的样本成功检测到少1 中基因的表达，其中2/3 的样本可以同时检测到三种基因的表达。而对细胞核的检测中，也能够检测到少一种基因的表达，如图4C 所示。在对比同一细胞同时提取细胞质（1.7 pL）和细胞核（1.3 pL）中这三种基因的表达时，可以发现两者基本相同，如图4D 所示。
图4： A)单细胞提取mRNA 转录实验的示意图；B)将提取物放入液滴中的方法；C) ERCC spike 为对照，测定细胞质中GFP、B2M、ACTB 的Ct 值；D)对同一细胞的细胞质与细胞核进行提取并测定Ct 值。
总结
随着生物研究越发趋于微观化，对于分析单个细胞的需求变得越来越大。但是由于单个细胞体积小，所能够提取出的物质相比以前细胞群落分析来说，难度显著提高。这不仅对检测仪器的灵敏度有了新的更高的要求，也同时对样本本身的质量也提出了更高的指标。本篇中使用FluidFM 提取活细胞所取得的样本质量相比于传统裂解手段有了明显的提高，从而取得了令人满意的结果。另外这种方法控制提取量后，甚能够做到不杀死细胞的情况下完成提取，这使得对于对单个细胞代谢测定的追踪成为了可能。
■ 单细胞提取与质谱联用的新型无损提取检测技术
单细胞代谢组学分析能够为对细胞功能分析提供诸多帮助。但是受制于测试条件问题，所得到的结果一直并不理想。随着质谱与单细胞提取手段的发展，目前已经出现了多种不同的提取方法。本文就基于FluidFM提取技术和MALDITOF联用的新型无损提取测试技术进行简述。
本文通过一种全新的方式，实现了从活细胞中直接提取细胞质研究代谢产物的方法。通过这种方法能够让研究者在不杀死细胞，不改变细胞周边环境的条件下研究细胞原始的代谢信息，并给持续监测同一个细胞提供了可能。相信在不久的将来使用FluidFM 技术提取技术将会帮助研究者更好的克服单细胞提取障碍，让研究者得到更加可靠、精准的单细胞信息。
作者通过使用直接购买的400 nm 孔径的FluidFM 探针成功从预先使用GFP-HeLa 细胞中提取出0.8~2.7 pL 的细胞质，一方面确保细胞存活，一方面足够用于检测。随后将细胞提取物放置在质谱专用的95 μm microarrays 上，并立即吹干，以猝灭酶的活性，如图1 所示。
图1，HeLa细胞活体提取过程。（A）提取前；（B）提取中；（C）提取后；（D）细胞质提储存在探针中；（E）移动到MAMS孔上；（F）释放提取液。
随后将9AA 喷涂在microarrays 表面，并放入质谱检测。他们成功通过这种方法检测到了各种酸类和磷酸类化合物，包括核糖核苷酸（cGMP）、UDP、ADP、ATP、活性糖(UDP-GlcNAc、UDP-Glc)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、谷胱甘肽。随后他们使用C13 标记的葡萄糖对细胞进行培养48h 并对细胞进行提取检测。一般来说质谱检测一般化合物的同位素峰往往以+1 为主。而U-13C 的主体骨架均已使用C13 标记，因此同位素累积高的物质即为代谢的主要产物。从结果上看同位素累计主要出现在核苷酸和活化糖上面，而谷氨酸和谷胱甘肽并没有出现同位素累积。这说明谷氨酸和谷胱甘肽来源于培养基，而葡萄糖主要通过糖磷酸途径合成活性糖和核酸。如图2所示。
图2，U-13C标记和天然的HeLa代谢产物的分析。箭头表示代谢物的峰。*谷胱甘肽峰。**13C UDP GLCNAC的 [M＋13- H]-峰。
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