双光子荧光显微镜

双光子荧光显微镜

北京大学谢晓亮教授(北大长江讲座教授;哈佛讲席教授,美国科学院院士)在美国哈佛大学使用LaVision BioTec的双光子显微镜之后,在北京大学建立北京生物动态光学成像中心之时,又再度引进双光子显微镜,并且给予显微镜该高度评价。

LaVision BioTec于2000在德国成立,作为一家专业的双光子显微镜和OPO振荡器、双光子分光器等设备生产商,LaVision BioTec在短短的10年内已经成功的为欧美等国家诸多大学和研究所提供了超过110套双光子显微镜设备和10多套片扫描(全面扫描)荧光显微镜,成为该领域质量最好的供应商。


产品特点

☆   光损伤小:由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源,这一波段的光对活体细胞和组织的光损伤小,适用于长时间的研究;

☆   穿透能力强:相对于紫外光,可见光和近红外光都具有更强的穿透能力,因而受生物组织散射的影响更小,解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题;研究表明,共聚焦荧光 成像的成像深度一般在50微米左右,而双光子显微镜的成像深度可达1000微米;

☆   高分辨率:由于双光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光,双光子吸收仅局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内;(more)

高穿透力,高分辨率的双光子显微镜能够有效透过组织对组织深层进行成像。

LaVision BioTec的双光子显微镜TriM Scope的独特优势(同类产品中独有的优点):

☆   全球独有的多光束快速扫描模式:用户可根据需要调节光束模式从传统的单光束扫描模式到La Vision BioTec独有的多光束快速扫描模式,即1、2、4、8、16、32、64束光的不同模式选择。多光束平行扫描技术是指入射光经过分光器,分解为64束光,同时进入显微镜,通过物镜聚焦在样品上,通过XY扫描器利用这64束光同时进行扫描,并调整Z轴进行三维成像,保证最低的样品损伤的同时极大地提高了扫描速度。

☆   全球第一个可用软件调节的双光子显微镜:ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式,并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。因此,TriM Scope 是研究光活化、光释放和光漂白(photo activation, uncaging and FRAP )的理想完美工具。

☆   同类产品中具有最优的检测效率:TriM Scop可以支持最多达8个 non-descanned PMT, NDD可以是cooled generation III GaAsP PMT或者APD detector可以多传输40%效率的量子,比同类产品具备更佳的检测效率。

☆   世界上唯一能够支持OPO技术的显微镜:OPO技术– 红光和蛋白的激发:经典的Ti:Sa激光器成像红光的能力是非常有限的,因为经典的激发波长是1125到1250 nm, 并不在Ti:Sa激光器的转换范围之类。OPO技术解决了这个问题,因为它能传输可调的fs激光脉冲到>1100 nm的范围。


第一代双光子显微镜:LaVision BioTec革新的技术提供了独特的双光子显微镜-TriM Scope I:  

☆   用户可根据需要调节光束模式:从传统的单光束扫描模式到La Vision BioTec的多光束快速扫描模式,即1、2、4、8、16、32、64束光的不同模式选择。快速扫描模式即可保证最大可允许64束光同时扫描,并且保证最低的样品损伤,主要有下面三个原因:

●  64束光能够提供单光束的64倍荧光强度并且保证低损伤高荧光强度

●  保证了高的帧速率

●  CCD摄像头比PMTs更高灵敏度

☆  TriM Scope 可以提供最多达8个NDD摄像头给经典的单光束扫描显微镜,2个CCD摄像头,1个TCSPC 探测器为FILM(Fluorescence Lifetime Imaging Microscope )测量。3 个NDD可以安装到靠近物镜的位置,2个 NDD可以插入到传送器。


☆   LaVision BioTec的ImSpector Pro软件支持了先进的扫描模式,并且支持用户在ms毫秒之内切换扫描区域。因此,TriM Scope 是研究光活化、光释放和光漂白(photo activation, uncaging and FRAP )的理想完美工具。

☆ TriM Scope 还可以结合1个OPO使用,OPO可以转换Ti:Sa激光器的波长从800-880 nm转变到1100-1300 nm。因此红光染料或者蛋白质可以被有效地激发出双光子,保证了很低的漂白率和最深的穿透深度。LaVision BioTec可以同时使用Ti:Sa激光和OPO来扫描,就能同时激发出绿/黄和红光。 



第二代双光子显微镜 : LaVision BioTec最新的双光子显微镜-第二代双光子显微镜TriM Scope II:    

☆   自动校准的双光子显微镜

☆   穿透最深的样品深度,并能应用OPO技术

☆   可升级到LaVision BioTec的64束光分光技术

☆   多用户使用环境中的双光子显微镜


TriM Scope II双光子显微镜提供了第二代的双光子显微镜,并且在各种使用环境下能够完成快速、深度成像。基本配置是单光束扫描元件,包括正置机身和2个靠近物镜的NDD检测器。作为选件,该显微镜可以配置:

☆   LaVision BioTec专利的光学分光器,用于64路光束的平行扫描

☆   最多可达到8个NDD检测器

☆   各种不同的CCD摄像头

☆   LaVision BioTec的快速TCSPS检测器

☆   用于共聚焦检测的descanned检测器

☆   预啁啾补偿器

☆   OPO (more)  




■    呼吸道网络中的神经元活动研究


    呼吸道网络中的神经元活动功能性地依赖于抑制性突触传递。我们使用双光子显微镜分析了独立吸气“pre-Bötzinger”复合物驱动网络的节律性切片。通过在吸气相关的呼吸过程中分别升高或降低细胞溶质内自由钙离子的浓度,我们识别出吸气(96%)和“紧张性”呼气(4%)神经元。而且,在GlyT2启动子控制下表达EGFP的BAC转基因的小鼠中,钙离子成像的50%的吸气神经元被甘氨酸化。切片中甘氨酸化神经元的吸气过程通过整个细胞记录的形式确认。我们同样发现了接受来自其它甘氨酸化神经元相位抑制的甘氨酸化神经元。我们的钙离子数据表明在节律性切片中的“pre-Bötzinger”复合物驱动网络中的甘氨酸化神经元包含了大量的吸气神经元。




■    肿瘤生长与入侵动态成像


    从首次感染部位向邻近基质的转移入侵是肿瘤发展过程中的关键步骤,研究成果较少。肿瘤入侵的原理以各种体外模型给出了实验性的表述;但是,体内的关键性步骤和机制仍然不清楚。这里,我们通过落射荧光成像和多光子显微镜建立了一个修正的皮肤折叠室模型来阐述关于HT-1080纤维肉瘤细胞的原位移植,生长和入侵。这种策略允许对作为独立细胞或者集体粘丝或者细胞团沿着富含胶原的细胞外基质和增补宿主组织包括纹状肌肉丝和淋巴管的肿瘤生长、肿瘤诱导血管形成和入侵进行重复成像。这个修正的窗口模型将适用于阐述肿瘤转移和入侵的机制,以及相关的实验性治疗。



 

■    双光子荧光显微镜应用于多焦点扫描与光激活蛋白 


    我们使用Lavision Biotec公司多焦点双光子激光扫描显微镜Trim Scope来进行局部和选择性的蛋白激活以及细胞内蛋白动态的的量化调查。局部激活使用光激活绿色荧光蛋白(pa-GFP)和光学双光子激发来实现,以调查实时原位的细胞内动态。这个过程对于深入理解和建模活细胞内的调控和代谢过程极其重要。作为范例,既包含了一个核输入信号又包含了一个核输出信号的拟南芥MYB转录因子LHY/CCA1-like 1 (LCL1)被定量化调查。我们使用了由质粒编码的光激活绿色荧光蛋白(pa-GFP)融合蛋白和一个红色荧光转染标记联合转染的烟草BY-2原生质体,并pa-GFPLCL1在核内光激活后的快速向核外输出。作为对照,一个LCL1核输出阴性突变体仍然被束缚在核内。我们确定了由激活pa-GFP-LCL1的双向核运输和pa-GFP的扩散分别导致的核内荧光下降的51s和125s的平均时间常。



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