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生物超大样品3维结构成像技术的比较

生物超大样品3维结构成像技术的比较

——光片照明显微镜与激光共聚焦/双光子显微镜

目前,在动植物发育、肿瘤研究、以及需要对细胞运动和细胞寿命进行追踪的基础研究中,普遍使用的设备是激光共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜。由于采用了垂直于样品的照明和检测光路,因此存在成像深度不够深、需要屏蔽离焦面荧光、光漂白与光毒性较大的问题。先进的双光子荧光显微镜虽然无需共焦小孔、降低了光漂白与光毒性、成像深度在理想情况下可以增加到1mm,但是价格昂贵且成像深度仍不理想。

采用最新光片照明技术的LaVision BioTec选择性光片照明(light-sheet microscopy, Selcetive plane illumination microscope, SPIM)显微镜--Ultramicroscope显微镜使用一层光束从样品侧面激发荧光样品即sheet illumination,通过CCD来检测成像,而入射照明光路和CCD接收荧光光路互相垂直。通过移动样品使入射光片激发不同的平面。激发光束从左右两个方向入射到样品上,光束的角度可以改变,这样就可以很容易的得到整个组织的3D图像,同时保证细胞水平的分辨率。由于样品受激发的平面就是成像平面,所以可以将光漂白和光学损伤降低到最低。整个系统配置可以达到大视野的快速摄像和3D成像。这也是Lavision特有的设计和配置,是全球唯一一款可以实现超大样品块、快速扫描、深度成像、高分辨率、3D动态图像输出的荧光显微镜。

光片照明显微镜与激光共聚焦/双光子显微镜的分项比较

比较项目

传统激光共聚焦与双光子显微镜

光片照明荧光显微镜

样品尺寸

可变FOV,与所用物镜相关,小于0.7 mm

12mm X 12mm X 10mm,适用于大样品

最大成像深度

0.2mm;利用双光子技术可接近1mm

10mm,适用于大样品

光毒性与光漂白

单光子激发时整个光路都会发生光毒性与光漂白;双光子激发时仅在焦点处发生光毒性与光漂白

仅在激发平面,也就是共焦平面发生光毒性与光漂白。光毒性与光漂白与双光子激发差不多

成像方式与成像速度

单点扫描成像,照明一个点成像一个点,速度慢

单次照明即可对整个共焦平面成像,成像速度快

照明方式

照明光束垂直于样品平面

光片从侧面照明,平行于样品平面

荧光检测路径

与照明路径重叠,垂直于样品平面

垂直于照明路径,垂直于样品平面

是否可用于活体成像

可以

可以

细胞寿命研究与细胞运动轨迹跟踪

很小范围内

可以在1.2cm X 1.2cm X 1cm范围内跟踪

阴影消除技术

左右双光片照明;光片可以5°角摆动扫描,以清除致密结构造成的阴影

离焦平面荧光处理

共焦小孔滤波;双光子技术不需要滤波

不需要小孔滤波

图像分辨率

分辨率如果增加,样品尺寸会减小;极限分辨率为光学衍射极限

光学衍射极限,像素分辨率可超过0.2um

价格

传统共聚焦与双光子显微镜价格昂贵

远低于同等品牌的传统共聚焦显微镜

 

 

     
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