最新的分子间相互作用分析技术
微量热泳动仪---MST |
德国Nano Temper公司 |
|
☆ 快速全面：10分钟测量解离常数Kd、化学计量学、结合能
☆ 高灵敏范围：从离子到复合物间作用（40Da-2.5MDa）
☆ 天然的环境：可以在血清和裂解液中测量而不需纯化
☆ 样品使用量低：nM的浓度下只需<6ul样品量
☆ 溶液测量：不需要固定到固相表面，保证样品天然构象
☆ 动力学范围：pM-mM的解离常数
☆ 极低消耗费、无维护费、非常简单易操作 |
 |
微量热泳动仪-microscale thermophoresis (MST)是由总部设在慕尼黑的德国高科技公司NanoTemper技术有限公司发明的设备。2010年底的一篇Nautre的文章《Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis》最先报道了NanoTemper公司创始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp使用MST测量生物溶液中蛋白-蛋白之间的相互作用，引起了很多科研人员的极大兴趣。随后这个产品正式投入市场，在2011年就有很多客户购买试用，2012-2014年就有250个国外的实验室购买使用，目前全球已超过350台仪器在为各个国家的科学家提供服务，而且在短短的两年多的时间内，相关数据已经发表到nature，cell，Science，PNAS等期刊，大大受到用户们的欢迎。微量热泳动仪MST的用户举例 
热泳动MST技术从2012年中期进入大中华区（大陆+港澳台+新加坡），我们已经帮助很多感兴趣的用户做了样品测试，以证明其强大的功能和广泛的应用范围，收到很多客户的好评，仅仅半年，国内知名高效研究院已经有20多位客户购买，，包括北大，清华，复旦，中大，中科院，中国药大，中国农大等著名高校的重点实验室。并且在给客户做过样品测试后，我们的客户都对该技术的操作方便性和样品消耗少等优势印象深刻，并愿意为我们提供推荐给其他实验室，或者联合写署名文章等等。MST产品的重要用户的评价请见链接： 微量热泳动仪MST的客户评价举例
1. 单链抗体与人源抗原蛋白的结合过程- MST测量纳米抗体和纳米抗体FC融合蛋白与人CD38之间的相互作用
2. 小分子化合物与模式蛋白的相互作用 - MST分析小片段分子与模式蛋白碳酸酐酶CAII的作用
3. 体外合成蛋白与结合物分子相互作用 - MST分析体外合成的蛋白与靶分子相互作用而不需纯化
4. DNA/RNA分子立体螺旋结构的行程 - MST分析DNA/RNA分子立体螺旋复杂结构的形成
5. 小分子抑制剂对蛋白激酶的抑制效应 - MST分析小分子化合物蛋白激酶的抑制，没有溶液成分（DMSO）限制
6. 钙离子和突出蛋白左右-标记/非标记 - MST分析离子对突触蛋白的结合作用
7. 蛋白结合小分子的热力学常数测量 - MST测量结合反应中的结合能ΔG、熵变ΔS和焓变
8. 生物素结合亲和素的化学计量学测量 - MST测量相互结合的分子的结合数目比例
1. Cell - 微量热泳动仪MST测量Grb2的二聚化 June 26th, 2012
John E. Ladbury（MD Anderson癌症中心，休斯敦）使用最新的分子间相互作用分析仪-微量热泳动仪MST -NT.115检测并定量化Grb2蛋白的二聚化。而寡聚化过程由于其浓度很低且需要很高的灵敏度，通常是非常难检测到的，使用MST可以很方便的直接检测和分析该过程。
2. ChemBioChem - 微量热泳动仪MST测量多肽和亚基结合 2013,14,746-752
南开大学元素有机化学国家重点实验室使用最新的分子间相互作用分析仪-微量热泳动仪MST -NT.115测量多肽和不同来源的AHASs的催化亚基CSU的亲和力并比较其差异，获得良好的数据并发表到最新一期的ChemBioChem杂志上。之前，该课题组尝试其他方法（包括ITC方法）测定没有得到结果，因为其样品稳定性很差无法固定并且相互作用热量变化极小。
|
微量热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）是指分子在微观的温度梯度场中的定向运动。生物分子结构/构象变化会引起其水化层、分子量、电荷的变化，而这种变化会导致分子在温度梯度场中的分布的改变，这种改变可以用来分析分子间的相互作用以及各种化学计量学参数。MST 可以直接在接近天然的环境（血清和细胞裂解液）、任意生物溶液中溶液中（无DMSO等有机溶剂浓度的限制）测量分子间相互作用，而不需要一个固定的表面，每次实验只需要4-6ul的样品量，使用低费用的毛细吸管来完成实验，能够在短短10分钟之内测量16个样品的数据，这些特点使得其成为一种最新的、方便、快速、高通量的分子间相互作用的分析仪器。而且，该技术极其灵敏，甚至可以检测到像蛋白质磷酸化或离子结合到蛋白质和DNA/RNA的微小的变化。
通过毛细吸管中心的红外激发和外围的冷却，毛细吸管中产生精确地微观区域的温度梯度差异，将所需要测量的溶液（缓冲液、血清、细胞裂解液和其它生物液体）填充到毛细吸管之中，然后通过监测分子的荧光信号的分布进而监测分子在温度梯度场中的分布。这个荧光信号可以使分子自发的荧光（如蛋白中的色氨酸）；或者标记荧光染料到蛋白上；或者使用融合表达蛋白（如GFP融合蛋白）。任何一级、二级、三级和/或四级结构的变化所导致的水化层的改变都会影响分子的热泳动效应，可以准确而灵敏测量分子间的相互作用以及分子结构的变化，即使是非常微小的构象变化也可以检测到，所以，其灵敏度也是其他传统技术无法比拟的。
NanoTemper提供两台设备以及相应的试剂耗材来完成分子间相互作用测量，包括荧光标记系统 (NT.115) 和无标记系统 (NT.LabelFree)，二合一系统 (NT.LabelFree + NT.LabelFree)，以及最新的全通量全自动版本 (NT.Automated)。
将4-6ul的样品填充在毛细血管之中，然后使用红外产生温度梯度场。由于结合物结合到标记分子导致标记分子在玻璃毛细管中荧光强度的分布产生变化，我们就能计算出到分子间结合力的强弱。用户既可使用标记的荧光染料/融合表达的荧光蛋白来观察分布(NT.115系统)，也可以用分子内自发荧光集团来检测(NT.LabelFree系统)；二合一系统 (NT.LabelFree + NT.LabelFree)，以及最新的全通量全自动版本 (NT.Automated) 可以检测自发荧光和标记荧光，NT.Automated还可以支持全自动加样进杨，高通量-96通道快速测量。
很简单的实验方法，使用便宜的毛细吸管作为耗材，避免了昂贵的样品消耗和繁琐的制备过程。
相对于其他的已有的测量分子间相互作用的技术，MST结合毛细管使用大大降低所需的实验成本，并且可以测量天然状态环境中的生物分子间的相互作用。
荧光分子的浓度的保持不变而结合物分子的浓度梯度增加。将6ul的样品量被填充在MST毛细血管，然后使用制造一个局部温度梯度。由于标记分子在玻璃毛细管中的运动导致的区域荧光强度变化就会被观测到。既可用标记的荧光染料/融合表达的荧光蛋白来发光(NT.115系统)，也可以用色氨酸自发荧光来检测(NT.LabelFree系统)。通过检测不同浓度的结合物分子对荧光分子热泳动平衡态的分布的影响，从而获得这两个分子间相互作用的各种参数。
荧光分子最初是自由均匀分布的。在红外激光照射下，分子受到热泳动的作用力，从加热区域向低温区域移动，同时分子又受到浓度梯度和质量扩散力的作用，最后分子在热泳动作用力和质量扩散作用力下达到平衡，形成稳定态。在关闭红外激光后，分子扩散重建均匀分布状态。下图显示了该过程。
样品处理方面：
☆ 不需要固定，在生物溶液中测量，无需纯化
☆ 无需标记测量
☆ 使用荧光染料/荧光蛋白具有良好的选择性
☆ 极低的样品消耗量
☆ 直接在脂质体或者去污剂中研究膜蛋白
☆ 10分钟之内测量任何（生物）分子间亲和力(KD, 解离常数)
☆ 测量sub-nM到mM 级的解离常数
☆ 可以选择特定温度下完成测量
☆ 研究各种不同大小的分子：离子、片段、核小体、脂质体
☆ 可以在各种不同的溶液环境中完成测量，包括研究膜蛋白所需的复杂的去污剂环境
☆ 广泛的样品兼容性：天然的环境中、生理学实验条件、血清、细胞裂解液
☆ 可以研究多组分反应：三元复合物、装配顺序、干扰因素、协同作用、类似物
☆ 可以区分靶标上不同的结合位点
☆ 可以测量生物分子的寡聚化
☆ 研究化学计量学并确定生物分子结合位点的数目
☆ 研究结合能量学ΔG (自由能 ), ΔH (焓) 和ΔS (熵)
☆ 研究蛋白的折叠和稳定性?
实验操作方面：
☆ 非常稳定的技术
维护费用方面：
☆ 更快得到数据用于发表文章
☆ 仪器小型化设计，占用空间少
|
生物分子相互作用：
离子、小分子、多肽、蛋白、核酸、脂类、糖… |
多组分反应：
三元复合物、核糖体、核小体、寡聚化、脂质体… |
|
无需纯化样品：
荧光标记蛋白、裂解液、血清、细胞上清液… |
生物物理学参数：
结合能、化学计量学、分子折叠… |
NT.115和 NT.LabelFree是部分优势互补的。 每个系统都有其特定的优势和特点，您需要根据你的具体应用来考虑。如果您有兴趣测量各种各样的不同的样品，我们建议考虑两个系统都使用。
|
NT.115: 测量标记荧光
可以在任何缓冲液和细胞裂解液中完成测量
通过标记，可以测量各种结合试验，包括离子，核糖体，组蛋白以及多组分反应
可以测量任何靶（生物）分子，而不依赖于梯度浓度的结合物独特的光谱学特征
可以测量sub-nM到mM间的亲和力 |
NT.LabelFree: 测量内在荧光
不需要经过标记步骤，因而能测量一些对标记过程敏感的蛋白，如膜受体
该系统非常敏感，甚至能检测靶标分子微小的基团的修饰
该系统能精确测量各种结合物，包括极弱甚至无内在荧光的分子，如核酸、糖、多数小分子和很多蛋白
可以测量10nM到mM间的亲和力 |